抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法技术

本发明专利技术涉及抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法。抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：它是由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体。由其制备的餐厨废弃油脂免疫层析免疫试纸条可用于餐厨废弃油脂可以用于快速检测餐厨废弃油脂中辣椒素类物质的总量；检测灵敏度高，pH适应范围广；一步式操作，简单方便。不需要辣椒素类物质标准溶液作为阳性对照。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗辣椒素类物质通用特异性抗体、试纸条及餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法，属于免疫化学

技术介绍
地沟油是一个泛指概念，是对各类劣质油的统称，一般包括泔水油、煎炸废油、食品及相关企业产生的废弃油脂，而来自餐饮业的泔水油是地沟油的主要原料来源之一。在我国饮食文化中，含有辣椒素的辣椒是必不可少的佐料之一。辣椒素类化合物是存在于辣椒果实中的使其具有辛辣刺激的主要化学物质，目前已经探明结构的有二十多种。辣椒素类物质营养价值高，被广泛应用与食品加工领域。合成辣椒素也有与天然辣椒素类物质相似的结构，也具辛辣特征，是辣椒素类物质中的一员，主要用于工业领域，但因其制备成本低，一些不法分子将其替代天然辣椒素，应用于食品领域。辣椒素、二氢辣椒素以及合成辣椒素是辣椒素类物质中的主要成员。辣椒素类物质营养价值高，被广泛应用与食品加工领域。辣椒碱素类物质具有脂溶性强、稳定性好、沸点高等特点。目前的地沟油加工工艺很难完全去除具有这样特点的物质。多项研究表明，正常食用油基本不含辣椒碱，而接触过辣椒的餐厨废弃油脂难以避免地含有这类成分。因此辣椒碱类成分可作为鉴别餐厨废弃油脂的特征指标，通过检测辣椒素类物质的含量，即可判别食用植物油中是否被掺入餐厨废弃油脂。目前，检测食用植物油中辣椒素类物质的方法主要有高效液相色谱法、色谱-质谱联用等现代仪器检测方法，其灵敏度高、准确性好，但是仪器设备昂贵，对实验环境要求高，且要求专业操作人员，难以实现快速检测。近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法的缺点，并具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、适于现场批量检测等优点，被广泛应用于医学、农学等各个领域。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析技术由于其检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，近年来在真菌毒素、农药残留等微量残留物的定性、在线、快速检测上得到了广泛应用。然而，目前国内外还未有将该方法应用于餐厨废弃油脂辣椒素类物质的检测中。胶体金免疫层析技术的核心元件是特异性的抗体，而餐厨废弃油脂基质成分复杂，样品提取液的pH难以确定，通常会使特异性抗体活性降低，检测灵敏度降低。因此，迫切需要研制亲和力高、特异型好、且耐有机溶剂、pH适应范围广的抗辣椒素类物质特异性抗体，并利用该抗体建立胶体金免疫层析试纸条检测法，用于鉴别餐厨废弃油脂。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种抗辣椒素类物质特异性抗体、餐厨废弃油脂胶体金免疫层析试纸条、餐厨废弃油脂免疫层析快速鉴别方法。本专利技术提供的抗辣椒素类物质特异性抗体亲和力高、特异性好、且耐有机溶剂、pH适应范围广。用其制作的免疫层析试纸条用于餐厨废弃油脂中辣椒素类物质的检测，具有操作简单、成本低廉、灵敏度高、pH适应范围广的特点。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：提供辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物，其结构式如式Ⅰ所述：提供上述辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的制备方法，包括以下具体步骤：以氢氧化钠中和香兰素胺盐酸盐中的盐酸，得到式Ⅲ化合物，然后与顺丁烯二酸酐反应，得到人工半抗原化合物，将辣椒素类物质人工半抗原通过N,N’-二环己基碳二亚胺DCC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或通过三正丁胺和氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白BSA进行偶联得到。人工半抗原化合物的合成路线如下：上述辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的制备方法具体包括以下步骤：(1)将摩尔比为1：(0.7～1.1)的香兰素胺盐酸盐和氢氧化钠溶于水中，室温搅拌10-30min，过滤后得到白色沉淀香兰素胺(式Ⅳ化合物)；将彻底干燥的香兰素胺与顺丁烯二酸酐以摩尔比为1:0.8-1.2溶于三氯甲烷中，室温反应1-2h，过滤后即得辣椒素类物质人工半抗原。(2)将辣椒素类物质通用人工半抗原在N,N-二甲基甲酰胺中与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应30min-2h，然后加入二环己基碳二亚胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应4-6小时，静置过夜，取上清液即活化的辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素人工半抗原溶液，所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-1.2；或将辣椒素类物质通用人工半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺中顺序加入三正丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应0.5-3h小时，所得反应液即活化的辣椒素类物质人工半抗原溶液，所述三正丁胺和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1-1.2。(3)将上述(1)所得活化的辣椒素类物质通用人工半抗原上清液滴加到载体蛋白浓度大于等于2mg/mL的载体蛋白的磷酸盐缓冲液中，室温条件反应4-8h，其中：所述步骤(1)中的辣椒素类物质通用人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于10:1，然后透析得到辣椒素人工抗原。按上述方案，所述的载体蛋白的磷酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解得到的。按上述方案，所述的透析为用0.01M PBS缓冲液透析72h，期间，4-8h更换一次透析液。抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其为由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体；按上述方案，所述的免疫为采用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后间隔重复免疫动物，其中：初次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫用弗氏不完全佐剂，至抗血清效价达到10000以上，颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清纯化得到辣椒素类物质抗体。用本专利技术提供的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达320000，得到的抗体对辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素的半抑制浓度IC50在pH值为5.0-8.0的条件下，为0.27-0.41μg/mL。表明该抗体可以特异性与辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素反应，并可以作为辣椒素、二氢辣椒素及合成辣椒素通用抗体，亲和力好，灵敏度高，稳定性好，包括耐受有机溶剂及盐离子浓度能力强、pH适用范围广。按上述方案，所述式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的免疫用量以其中的OVA蛋白计为0.2-1.0mg；免疫层数为4-6次；首次免疫采用等体积的弗氏完全佐剂乳化免疫原，于兔皮下多点注射；首次免疫后间隔2-4周进行第二次免疫，第二次及以后的免疫间隔2-3周，由等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫原，于兔背部皮下多点注射。从第四次开始，每次免疫一周后6-10天内，兔耳缘静脉采血非竞争间接ELISA方法测定血清效价，效价达到10000后，即兔颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，得到辣椒素类物质抗体。餐厨废弃油脂免疫层析试纸条(见图3)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的上述抗辣椒素类物质通用特异性抗体。按上述方案，所述的吸水垫长10～15mm，宽3～4mm，检测垫长25～30mm，宽3～4mm；金标垫长6～9mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。按上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：它是由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体；

【技术特征摘要】
1.抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：它是由式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物免疫动物，并分离纯化后冷冻干燥获得的抗辣椒素类物质通用特异性抗体；2.根据权利要求1所述的抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：所述的免疫为采用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后间隔重复免疫动物，其中：初次免疫用弗氏完全佐剂，后续免疫用弗氏不完全佐剂，至抗血清效价达到10000以上，颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清纯化得到辣椒素类物质抗体。3.根据权利要求1所述的抗辣椒素类物质通用特异性抗体，其特征在于：所述式Ⅰ所述的辣椒素类物质通用人工免疫抗原化合物的免疫用量以其中的OVA蛋白计为0.2-1.0mg；免疫层数为4-6次；首次免疫采用等体积的弗氏完全佐剂乳化免疫原，于兔皮下多点注射；首次免疫后间隔2-4周进行第二次免疫，第二次及以后的免疫间隔2-3周，由等体积的弗氏不完全佐剂乳化免疫原，于兔背部皮下多点注射。从第四次开始，每次免疫一周后6-10天内，兔耳缘静脉采血非竞争间接ELISA方法测定血清效价，效价达到10000后，即兔颈动脉采血至其死亡，采到的血液离心后，将抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，得到辣椒素类物质抗体。4.餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的权利要求1所述的抗辣椒素类物质通用特异性抗体。5.根据权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长10～15mm，宽3～4mm，检测垫长25～30mm，宽3～4mm；金标垫长6～9mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述的吸水垫为吸水纸。6.根据权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8～20mm，所述检测线与质控线的间距为5～10mm；所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm。7.根据权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条，其特征在于：所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：所述检测垫检测线上每厘米所需要的包被抗原的包被量为0.1～0.6μg；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用特异性抗体的用量为0.40～0.98μg。8.权利要求4所述的餐厨废弃油脂免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.17～1.0mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，杨青青，张奇，马飞，张良晓，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42