一种高效生产重组禽腺联病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效生产重组禽腺联病毒的方法,该方法是首先分别构建获得表达AAAV功能蛋白基因Rep78、Rep52的重组杆状病毒rBacRep、表达AAAV 3种结构蛋白基因VP1、VP2、VP3的重组杆状病毒rBacVP、表达绿色荧光蛋白报告基因的重组杆状病毒rBacGFP；然后将rBacRep、rBacVP、rBacGFP同时感染昆虫细胞Sf9，制得rAAAV‑GFP。荧光定量PCR检测每个Sf9细胞可产生rAAAV‑GFP约28000VG，比传统三质粒法提高了约20倍。本发明专利技术不仅操作程序简便，病毒滴度大大提高，而且易进行大规模生产，克服了rAAAV作为新型病毒基因转移载体使用的瓶颈。

【技术实现步骤摘要】

一种高效生产重组禽腺联病毒的方法，用于重组禽腺联病毒的生产应用，属于生物制品领域，本专利技术涉及重组AAAV(禽腺联病毒)载体，以及该病毒载体的制备方法。
技术介绍
腺联病毒(AAV)又称腺相关病毒，属细小病毒科依赖病毒属，是一种复制缺陷型单链DNA病毒，需要腺病毒等辅助病毒才能复制产生子代病毒。重组腺联病毒是目前公认的最有前景的基因转移载体之一，具备对宿主没有致病性、免疫原性极低、宿主范围广等优点，因此广泛地用于基因治疗和基因工程疫苗等方面的研究，有的已进入人体临床试验。重组腺联病毒的制备方法主要是三质粒共转染法，即将含有顺式(携带末端反向重复序列ITR和外源基因)、反式(编码功能蛋白rep和结构蛋白cap)和辅助基因的三种质粒共同转染293细胞系，这种方法成本偏高、程序较繁、不宜扩大生产，且获得的重组腺联病毒滴度偏低。2002年Masahi等发现功能蛋白Rep78在昆虫细胞Sf9中无需辅助病毒或质粒就能支持AAV DNA复制，将重组病毒/昆虫细胞系统应用于rAAV的生产，这种方法克服了传统三质粒法的弊端，重组腺联病毒(rAAV)滴度大大提高，生产出的rAAV与使用293细胞生产得到的病毒载体在生物功能上没有差异，杆状病毒/昆虫细胞悬浮生产系统被证明是一种简单、高效、经济的可以大规模生产的方法。禽腺联病毒(AAAV)的理化性质、基因组结构等与AAV基本相似，提示可作为新型高效的家禽基因转移载体进行开发应用。Perozo等以重组禽腺联病毒(rAAAV)为载体分别构建了表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)和鸡新城疫病毒(NDV)保护性抗原的基因工程疫苗，取得了良好的保护效果。本课题组也以rAAAV为基因转移载体成功介导人组织激肽释放酶在鸡输卵管上皮细胞中的高效表达，表达时间可达6W，明显优于以质粒载体介导的表达水平(表达之间约5天左右)；将RNA干扰技术与rAAAV载体相结合，实现了细胞水平miRNA的有效表达和较好的抑制作用。由于禽腺联病毒对家禽不致病，所以相关研究报道较少，对rAAAV的研究和开发应用则更少。目前rAAAV的制备方法依然是三质粒共转染法，这种方法存在病毒滴度较低、不易扩大生产等严重制约rAAAV作为新型病毒载体应用的瓶颈。因此，有必要研制出一种安全高效生产重组禽腺联病毒的方法。虽然AAAV的基因组结构与AAV相似，但是仍然存在一些生物学特性上的差异，如细胞嗜性、宿主范围等。所以，AAAV能否在没有辅助病毒存在的情况下在昆虫细胞内完成复制？能否利用昆虫细胞来制备rAAAV？这些问题都仍未可知。如何在昆虫细胞中同时表达其功能蛋白？如何优化AAAV三个结构蛋白的比例从而提高rAAAV的包装效率？都有待研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种安全高效的生产重组禽腺联病毒的方法，以克服rAAAV在生产实践使用中的瓶颈，促进其作为一种新型基因转移载体在外源基因的表达及相关的疫苗研制方面的生产应用。本专利技术首先分别构建获得表达AAAV功能蛋白基因Rep78、Rep52的重组杆状病毒rBacRep、表达AAAV 3种结构蛋白基因VP1、VP2、VP3的重组杆状病毒rBacVP、表达绿色荧光蛋白报告基因的重组杆状病毒rBacGFP；然后将rBacRep、rBacVP、rBacGFP分别以MOI为5同时感染昆虫细胞Sf9，72h后收集细胞沉淀，经反复冻融即为rAAAV-GFP；收集的病毒液经氯仿抽提PEG沉淀进行纯化。本专利技术的方法包括以下步骤：(1)含AAAV功能蛋白基因Rep78、Rep52双表达重组质粒pFB-Rep的构建及重组杆状病毒rBacRep的制备；(2)含AAAV 3种结构蛋白基因VP1、VP2、VP3重组质粒pFB-VP的构建及重组杆状病毒rBacVP的制备；(3)含巨细胞CMV启动子调控的绿色荧光蛋白报告基因转移载体pFB-ITRGFP的构建及重组杆状病毒rBacGFP的制备；(4)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP的扩增；(5)昆虫细胞Sf9的悬浮培养；(6)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP共感染Sf9细胞，收获rAAAV-GFP；(7)rAAAV-GFP的纯化。其中，(1)(3)所述中重组质粒载体的构建用到的载体为Invitrogen公司Bac-to-Bac系统中的杆状病毒转移载体pFastBac1。功能蛋白基因Rep78、Rep52的扩增引物分别为：Rep78-F/R:5′-CTAGCTAGCATGAGGTCGTACTACGAGGTC-′3/5′-CTAGCTAGCTCAGCCGCAGCGTTGACTCCC-′3；Rep52-F/R:′-CTAGTCGACATGGAGCTCGTGGATTGGCTC-′3/5′-CTAGCGGCCGCTCAGCCGCAGCGTTGACTCCC-′3。结构蛋白基因VP的扩增引物为：VP-F/R5′-CATGCGGCCGCCACGGCTCTTATTTCTGACGCGATACCCGATTGGTTG-′3/5′-CGTAAGCTTTTACAGCGGTTTGGTGAGGTAACGGGTACCG-′3。步骤(2)所述中重组质粒载体的构建用到的载体为Invitrogen公司Bac-to-Bac系统中的杆状病毒转移载体pFastBacDual。步骤(3)所述中GFP报告基因为Clontech公司产品pEGFP-N1。步骤(1)(2)(3)(4)所述中重组杆状病毒的制备及扩增均参照Invitrogen公司Bac-to-Bac说明书进行。步骤(5)所述中Sf9细胞的培养直接在摇瓶中进行，初始接种密度不低于5×105cells/ml，27℃110rpm/m培养至密度约2×106cells/ml，接种杆状病毒。步骤(6)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP均以感染复数5感染Sf9细胞，感染后72h离心收集细胞沉淀，反复冻融3-5次，10000rpm/m离心5min收集上清，即为rAAAV-GFP初始病毒液。步骤(7)所述中rAAAV的纯化采用氯仿抽提和PEG沉淀法。本专利技术的优点是操作简便，只需将三种重组杆状病毒同时感染昆虫细胞Sf9，而传统的三质粒法需要借助传染试剂将三种质粒同时转染293细胞，转染效率较低；重组病毒滴度大大提高，杆状病毒/昆虫细胞系统制备的rAAAV滴度比传统的三质粒法制备的rAAAV滴度高20倍左右，每个Sf9细胞可以生产约28000VG重组病毒；易于进行扩大生产，昆虫细胞Sf9是一种悬浮培养细胞，培养要求较低，非常适合生产实践中大规模生产，具有广阔的应用前景。鉴于此，本专利技术公开一种高效生产rAAAV的方法，通过杆状病毒双表达载体pFastBacDual在昆虫细胞中同时表达功能蛋白Rep78和Rep52，通过基因定点突变优化AAAV三个结构蛋白VP1、VP2、VP3的表达比例，以绿色荧光蛋白GFP为报告基因，用杆状病毒/昆虫细胞系统来代替传统的三质粒共转染法制备rAAAV，应用于生产实践。这种方法不但大大提高了rAAAV的滴度，且昆虫细胞Sf9易于大规模培养，操作简便，便于生产实践中扩大使用，具有非常广阔的应用前景。附图说明图1实施例1中功能蛋白Rep本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效生产重组禽腺联病毒方法，其特征包括以下步骤：(1)含AAAV功能蛋白基因Rep78、Rep52双表达重组质粒pFB‑Rep的构建及重组杆状病毒rBacRep的制备；(2)含AAAV 3种结构蛋白基因VP1、VP2、VP3重组质粒pFB‑VP的构建及重组杆状病毒rBacVP的制备；(3)含巨细胞CMV启动子调控的绿色荧光蛋白报告基因转移载体pFB‑ITRGFP的构建及重组杆状病毒rBacGFP的制备；(4)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP的扩增；(5)昆虫细胞Sf9的悬浮培养；(6)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP共感染Sf9细胞，收获rAAAV‑GFP；(7)rAAAV‑GFP的纯化。

【技术特征摘要】
1.一种高效生产重组禽腺联病毒方法，其特征包括以下步骤：(1)含AAAV功能蛋白基因Rep78、Rep52双表达重组质粒pFB-Rep的构建及重组杆状病毒rBacRep的制备；(2)含AAAV 3种结构蛋白基因VP1、VP2、VP3重组质粒pFB-VP的构建及重组杆状病毒rBacVP的制备；(3)含巨细胞CMV启动子调控的绿色荧光蛋白报告基因转移载体pFB-ITRGFP的构建及重组杆状病毒rBacGFP的制备；(4)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP的扩增；(5)昆虫细胞Sf9的悬浮培养；(6)三种杆状病毒rBacRep、rBacVP、rBacGFP共感染Sf9细胞，收获rAAAV-GFP；(7)rAAAV-GFP的纯化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，功能蛋白基因Rep78、Rep52的扩增引物分别为：Rep78-F/R:5′-CTAGCTAGCATGAGGTCGTACTACGAGGTC-′3/5′-CTAGCTAGCTCAGCCGCAGCGTTGACTCCC-′3；Rep52-F/R:5′-CTAGTCGACATGGAGCTCGTGGATTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王安平，朱善元，王永娟，左伟勇，吴双，郭长明，秦枫，洪伟鸣，
申请(专利权)人：王安平，朱善元，
类型：发明
国别省市：江苏;32