本发明专利技术涉及一种表达AA9家族多糖单加氧酶基因TLAA9‑4的毕赤酵母工程菌株；该工程菌表达的糖苷水解酶TLAA9‑4对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，混合酶比原始内切酶N24的降解纤维素的活性提高1.3倍。TLAA9‑4多糖单加氧酶发挥其活性需要供电子体(抗坏血酸或CDH)的存在，经薄层层析(TLC)检测产生多种纤维寡糖。TLAA9‑4具有良好的热稳定性和提高纤维素酶活力的能力，可广泛用于纤维废料及其它工业领域，具有重大经济价值和社会价值。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及生物工程，具体地说是一种表达是疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖单加氧酶基因TLAA9-4的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9-4。(二)
技术介绍
多糖单加氧酶(英语：Polysaccharide monooxygenases)，又称多糖单氧酶)是一种专门氧化裂解糖苷键，并产生多个纤维寡糖分子的酵素，也是自然界中的常见酵素之一。这类蛋白质在人类的产业上也有所应用，例如用来将纤维素与半纤维素等生物质能降解成可用的小分子。多糖单加氧酶具有多个家族。疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus是一种广泛分布于堆肥中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶和AA9家族多糖单加氧酶。疏绵状嗜热丝孢菌产生的AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-4具有氧化裂解纤维素的作用，并且对该菌株产生的内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用,可使其活性提高1.3倍。多糖单加氧酶发挥其活性需要供电子体(抗坏血酸或CDH)的存在，经薄层层析(TLC)检测产生多种纤维寡糖。该酶在缺乏底物的情况下可以产生过氧化氢，并且经飞行质谱鉴定该酶氧化裂解打断纤维素长链C1氧化也有C4氧化。(三)
技术实现思路
本专利技术从疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus获得多糖单加氧酶cDNA序列全长，命名为TLAA9-4，TLAA9-4基因DNA全长984bp，包括信号肽序 列，起始密码子和终止密码子，无内含子，编码306个氨基酸。具有信号肽序列(1-21aaMAFSTVTVFVTFLAFISIASA)及52个O糖基化位点,有6个潜在的N糖基化位点。将TLAA9-4编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于多糖单加氧酶第AA9家族。构建重组表达质粒载体pPICZαA/TLAA9-4，利用电转仪进行电击转化Pichiapastoris GS115，在Zeocin培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，高浓度博来霉素筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-CT-9-4。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，多糖单加氧酶的表达量为3.02mg/ml，分子量为39kDa，TLAA9-4最适温度为50-55℃，在60℃下是稳定的，处理60min后仍有95％以上的酶活性；70℃处理30min后仍保持71％的活性；80℃处理30min后保持27％的活性；90℃处理30min活性几乎完全丧失。AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-4在供电子体(抗坏血酸和CDH)和铜离子存在下能将纤维素长链氧化裂解为不同的纤维寡糖，并且在缺乏底物的情况下可以产生过氧化氢，对内切纤维素酶N24的酶活性具有明显的促进作用，混合酶比原始酶N24的降解纤维素的能力提高1.3倍。多糖单加氧酶第一个组氨酸具有重要作用，前端连有其他氨基酸会影响其活性。不同的多糖单加氧酶氧化裂解纤维素长链发生在不同的连键位置，经飞行质谱鉴定TLAA9-4氧化裂解纤维素长链发生在C1和C4位置。(四)附图说明：图1 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-4的SDS-PAGE分析泳道1：低分子量蛋白标准泳道2：纯化的AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-4图2 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-4的最适温度图3 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-4对内切纤维素酶N24活性的促进作用图4 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-1氧化裂解纤维素薄层层析检测及供电子体(抗坏血酸)对AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-1活性的影响泳道1：未加抗坏血酸的多糖单加氧酶TLAA9-1(E)泳道2：添加抗坏血酸的多糖单加氧酶TLAA9-1(E+Vc)泳道3：标准纤维寡糖分子(M)图5 AA9家族多糖单加氧酶TLAA9-1酶解产物飞行质谱分析(五)具体实施方式实施例1：疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosusermophilum的分离鉴定(1)标本采集：从堆肥中采集。(2)分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。(3)鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。实施例2：多糖单加氧酶基因TLAA9-4的克隆(1)疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosusermophilum总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。(2)cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1～2μg总RNA，加RNase Free ddH2O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture 2μL，10×RT Buffer(Mg2+)2μL，25mmol/L MgCl24μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer 1μL，RNase Inhibiter 0.5μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL(Final Volume 20μL)，将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH2O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。(3)PCR反应(25μL)：cDNA2μL,10×Buffer 2.5μL,10mmol/L dNTP2μL,25mmol/LMgCl22μL，上、下游引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH2O 12μL。反应条件为94℃5min预变性；94℃40s，56℃40s，72℃1min,共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。上游引物：5’-AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACATGGCTTCGTGACAAAAAT-3’下游引物：5’-GAGTTTTTGTTCTAGACCGGTCCTGGCTGGTGGTGC-3’(4)基因克隆：取0.5μl PCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TAKARA公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。(5)质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。(6)序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行。序列引物为M13启动子引物。疏绵状嗜热丝孢菌TLAA9-4基因cDNA全长984bp，包含起始密码子和终止密码子，无内含子，编码306个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于多糖单加氧酶第AA9家族。该序列如下：(A)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征：*长度：984碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；* 拓扑结构：线性(b)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖单加氧酶基因TLAA9‑4的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT‑PCR方法从疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus获得热稳定AA9家族糖苷水解酶基因TLAA9‑4,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA,获得表达重组质粒pPICZαA/TLAA9‑4,转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定多糖单加氧酶基因TLAA9‑4的毕赤酵母工程菌株GS‑CT‑9‑4，该糖苷水解酶TLAA9‑4对内切纤维素酶的活性具有明显的促进作用，并且能够将磷酸膨胀纤维素氧化裂解为纤维寡糖，飞行质谱结果鉴定氧化裂解裂解纤维素长链主既有C1氧化也有C4氧化。
【技术特征摘要】
1.一种表达疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖单加氧酶基因TLAA9-4的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR方法从疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus获得热稳定AA9家族糖苷水解酶基因TLAA9-4,将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZα...
【专利技术属性】
技术研发人员：李多川，耿志刚，陈铭，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。