一种α-酮戊二酸和丙酮酸联产的发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种α‑酮戊二酸和丙酮酸联产的发酵方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术考虑到α‑酮戊二酸和丙酮酸的商业价值差异不大，因此将两种羧酸进行联产。在羧酸联产发酵过程中，控制合适的甘油初始浓度以及流加速度促进菌体生长和羧酸的积累。本发明专利技术能够大大提高底物转化率、总酸产量、生产强度，缩短发酵周期，达到节能减耗、提高经济效益的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种α-酮戊二酸和丙酮酸联产的发酵方法，属于发酵工程

技术介绍
α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid，简称α-KG)和丙酮酸(Pyruvic acid)是细胞代谢过程中重要的两种短链羧酸分子，都可以广泛应用于食品、医药、化工等领域。目前，这两种有机酸在工业生产中主要是通过化工合成的方法，但是化工合成中存在有毒物质的使用、收率低等缺点，这些弊端限制了产品在医药、食品等领域的使用。微生物发酵法可以利用多种可再生碳源生产多种产品，不仅可以提高产品安全性，而且可以降低生产过程中的污染。解脂亚洛酵母(Y.lipolytica)WSH-Z06是一株能够以甘油为唯一碳源积累α-酮戊二酸的硫胺素营养缺陷型高产菌株。但是在其积累α-酮戊二酸过程中会伴随着一定量的丙酮酸的积累，这使得在以积累α-酮戊二酸为目的的发酵中，在发酵后期需要通过补加硫酸控制pH的方法使前期积累的丙酮酸转化为α-酮戊二酸。但这样做有以下缺点：发酵周期延长、硫酸的添加会增加新的杂质、底物转化率较低；在工业生产中，这些弊端都会放大，给生产带来不便。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服上述发酵过程的不足，提供一种提高底物转化率和缩短生产周期的α-酮戊二酸和丙酮酸联产的发酵方法。本专利技术实现上述目的所采用的技术方案包括如下步骤：(1)菌种活化：制备解脂亚洛酵母WSH-Z06的二级种子液；流加发酵：将种子液按10％接种量接到发酵培养基中进行发酵培养，在发酵前期，利用发酵培养基中的碳酸钙作为pH缓冲剂，当pH自然下降至3.0时，用20％Ca(OH)2控制pH维持在3.0；在发酵过程中，当甘油浓度降到20～30g/L时，按43.75g/h的流速恒速流加纯甘油至总甘油浓度为150g/L，144h结束发酵。在本专利技术的一种能够实施方式中，步骤(1)将菌种从甘油管接种到茄型瓶斜面种子培养基中活化，28℃培养24h后，将活化的种子接到种子培养基，28℃培养18h后，将一级种子液按0.5％接种量接到种子培养基中，28℃培养18h后。在本专利技术的一种能够实施方式中，步骤(2)中当甘油浓度降到26g/L，开始流加甘油。所述的种子培养基的组成为(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白10，磷酸二氢钾1.0，七水硫酸镁0.5。固体培养基中加入20g/L琼脂。所述的发酵培养基组成为(g/L)：甘油50，硫酸铵3，磷酸二氢钾3，七水硫酸镁1.2，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，盐酸硫胺6×10-7，乙酸钠6，碳酸钙10。本专利技术考虑到α-酮戊二酸和丙酮酸的商业价值差异不大，因此将两种羧酸进行联产，可以大大提高底物转化率、总酸产量、生产强度，缩短发酵周期，达到节能减耗、提高经济效益的目的。在羧酸联产发酵过程中，控制合适的甘油初始浓度以及流加速度促进菌体生长和羧酸的积累。附图说明图1实施例1发酵过程中各参数变化情况，菌体干重(■)；α-酮戊二酸(●)；丙酮酸(○)；甘油(▲)；pH(△)。图2实施例2发酵过程中各参数变化情况，菌体干重(■)；α-酮戊二酸(●)；丙酮酸(○)；甘油(▲)；pH(△)。图3实施例3发酵过程中各参数变化情况，菌体干重(■)；α-酮戊二酸(●)；丙酮酸(○)；甘油(▲)；pH(△)。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。种子培养液的组成为(g/L)：葡萄糖20，大豆蛋白10，磷酸二氢钾1.0，七水硫酸镁0.5；固体培养基中加入20g/L琼脂。发酵培养基组成为(g/L)：甘油50，硫酸铵3，磷酸二氢钾3，七水硫酸镁1.2，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.1，盐酸硫胺6×10-7，乙酸钠6，碳酸钙10。细胞干重的测定：准确吸取1mL发酵液于50mL容量瓶，加入15mL 2mol/L盐酸的与发酵液中的CaCO3充分反应，用去离子水定容后混合均匀，在570nm处测定OD值。根据OD570:细胞干重(g/L)＝1:0.223，计算细胞干重。α-酮戊二酸、丙酮酸和和甘油的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器)，色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column，流动相：5mM H2SO4，流速：0.6mL/min，柱温：40℃，进样量：10μL。紫外检测器波长：210nm(检测α-酮戊二酸和丙酮酸)，示差折光检测器：检测甘油。样品制备：1mL发酵液于12,000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。底物转化率(％)＝(α-酮戊二酸产量+丙酮酸产量)*100/总甘油浓度，单独生产α-酮戊二酸时，丙酮酸产量取0。生产强度(g/(L*h))＝(α-酮戊二酸产量+丙酮酸产量)/发酵周期，单独生产α-酮戊二酸时，丙酮酸产量取0。实施例1初始甘油浓度50g/L并且后期补加甘油条件下羧酸联产步骤一、将解脂亚洛酵母WSH-Z06从甘油管接种到茄型瓶斜面活化，28℃培养24h后，用接种环将活化的种子接一环到一级种子培养基，28℃培养18h后，将一级种子液按0.5％接种量接到二级种子培养基中，28℃培养18h后，再将二级种子液按10％接种量接到发酵培养基中，于28℃进行发酵培养。一级种子培养方法为：500mL三角瓶中装液量50mL，培养温度28℃，转速200r/min，培养17-18h。二级种子培养方法为：15L种子罐中装液量10.5L，接种量0.5％，培养温度28℃，搅拌转速300r/min，通气量1vvm，培养17-18h。步骤二、在发酵前期，依靠发酵培养基中的10g/L的碳酸钙作为pH缓冲剂，当pH自然下降至3.0时，用20％Ca(OH)2溶液控制pH维持在3.0。发酵过程中，24h左右当发酵液中甘油浓度降到26g/L，按43.75g/h的流速恒速流加纯甘油使总甘油用量达到150g/L，期间甘油浓度维持在20-30g/L。144h结束发酵。发酵结束后，测得总酸产量为106.7g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸产量分别为67.4g/L和39.3g/L。实施例2初始甘油浓度150g/L条件下羧酸联产步骤一、将解脂亚洛酵母WSH-Z06从甘油管接种到茄型瓶斜面活化，28℃培养24h后，用接种环将活化的种子接一环到一级种子培养基，28℃培养18h后，将一级种子液按0.5％接种量接到二级种子培养基中，28℃培养18h后，再将二级种子液按10％接种量接到发酵培养基中，于28℃进行发酵培养。步骤二、在发酵前期，依靠发酵培养基中的10g/L的碳酸钙作为pH缓冲剂，当pH自然下降至3.0时，用20％Ca(OH)2溶液控制pH维持在3.0。发酵过程中，初始甘油浓度为150g/L，发酵期间不补加甘油，144h结束发酵。发酵结束后，测得总酸产量为75.7g/L，α-酮戊二酸和丙酮酸产量分别为61.5g/L和14.2g/L。实施例3初始甘油浓度50g/L并且后期补加甘油条件下只生产α-酮戊二酸步骤一、将菌种从甘油管接种到茄型瓶斜面活化，28℃培养24h后，用接种环将活化的种子接一环到一级种子培养基，28℃培养18h后，将一级种子液按0.5％接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑酮戊二酸和丙酮酸联产的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：制备解脂亚洛酵母WSH‑Z06的二级种子液；(2)流加发酵：将种子液按10％接种量接到发酵培养基中进行发酵培养，在发酵前期，利用发酵培养基中的碳酸钙作为pH缓冲剂，当pH自然下降至3.0时，用20％Ca(OH)2控制pH维持在3.0；在发酵过程中，当甘油浓度降到20～30g/L时，按43.75g/h的流速恒速流加纯甘油至甘油总用量为150g/L，144h结束发酵。

【技术特征摘要】
1.一种α-酮戊二酸和丙酮酸联产的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：制备解脂亚洛酵母WSH-Z06的二级种子液；(2)流加发酵：将种子液按10％接种量接到发酵培养基中进行发酵培养，在发酵前期，利用发酵培养基中的碳酸钙作为pH缓冲剂，当pH自然下降至3.0时，用20％Ca(OH)2控制pH维持在3.0；在发酵过程中，当甘油浓度降到20～30g/L时，按43.75g/h的流速恒速流加纯甘油至甘油总用量为150g/L，144h结束发酵。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基按g/L计组成为：甘油50，硫酸铵3，磷酸二氢钾...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，张海林，堵国成，刘松，方芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32