一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术所提供的工程菌的构建方法，包括A1)和A2)：A1)向受体细胞中导入L‑脯氨酸‑4‑羟化酶基因、谷氨酸‑5‑激酶基因和谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶基因；A2)为将受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶基因、异柠檬酸裂解酶基因或脯氨酸脱氢酶基因敲除、或用乙酰辅酶A合成酶基因替换受体细胞的丙酮酸氧化酶基因；利用重组细胞与底物进行反应得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。实验证明，可以利用本发明专利技术的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的生产方法生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)是广泛存在于动物胶和骨胶原中的亚氨基酸，分子式如式1。反式-4-羟基-L-脯氨酸可以作为胶原蛋白合成的增强剂而用于化妆品和医药产品行业。也可以作为许多组织(如皮肤、骨骼和消化道)的补充营养物而用于食品行业。此外，反式-4-羟基-L-脯氨酸带有手性分子，是合成药物时有用的手性元件。其有用的衍生品包括MK-1220、聚胺-4-L-羟脯氨酸和N-乙酰-羟脯氨酸(奥沙西罗)。MK-1220被认为是一个高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂；聚胺-4-L-羟脯氨酸被用作非降解性丙烯酸骨结合剂；N-乙酰-羟脯氨酸可以抑制炎症和减少肿胀，是有用的治疗骨关节炎等影响结缔组织疾病，奥沙西罗已经被确立为一种无毒副作用的治疗关节疾病的药物。目前，生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法是生物提取法：利用动物蛋白如明胶、猪皮为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟基-L-脯氨酸，该方法纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重。随着脯氨酸-4-羟化酶的开发和生物技术的发展，利用微生物生产反式-4-羟基-L-脯氨酸成为可能。国外，Shibasaki等人于2000发表文章称已构建可以工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和L-脯氨酸的培养基中，用大肠杆菌过量表达L-脯氨酸-4-羟化酶来转化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。国内，刘合栋等人于2013年构建了过量表达L-脯氨酸-4-羟化酶的大肠杆菌，利用葡萄糖做底物，发酵法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。以上方法的共同缺点是耗时较长，而且L-脯氨酸做底物，成本昂贵。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何低成本生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，该方法以谷氨酸和/或可溶性谷氨酸盐为底物，葡糖糖作辅因子，利用工程菌全细胞转化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，不但降低了生产成本，还缩短了生产周期。本专利技术所提供的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进行反应得到反式-4-羟基-L-脯氨酸；所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造得到重组细胞的步骤：A1)向所述受体细胞中导入L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)基因；A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-激酶(ProB)基因；A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-半醛脱氢酶(ProA)基因；A4)为如下B1)、B2)、B3)和B4)这四种中的任一种、任两种、任三种或四种：B1)将所述受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶(SucA)基因敲除，该改造以“ΔsucA”表示；B2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶(AceA)基因敲除，该改造以“ΔaceA”表示；B3)为如下B31)和B32)，该改造以“ΔpoxB::acs”表示：B31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶(PoxB)基因敲除；B32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶A合成酶(Acs)基因；B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶(PutA)基因敲除，该改造以“ΔputA”表示；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。上述方法中，所述受体细胞为大肠杆菌。所述受体细胞具体可为大肠杆菌K12。上述方法中，所述底物可为谷氨酸或/和可溶性谷氨酸盐。上述方法中，B3)可为用所述乙酰辅酶A合成酶基因替换所述受体细胞的所述丙酮酸氧化酶基因。上述敲除和替换均可通过同源重组实现。上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶可为如下G1)或G2)的蛋白质：G1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；G2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羟化酶功能的由G1)衍生的蛋白质；所述谷氨酸-5-激酶可为下述H1)或H2)的蛋白质：H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由H1)衍生的蛋白质；所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶可为下述I 1)或I2)的蛋白质：I1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；I2)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶功能的由I1)衍生的蛋白质；所述α－酮戊二酸脱氢酶可为下述J1)或J2)的蛋白质：J1)氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质；J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述α－酮戊二酸脱氢酶功能的由J1)衍生的蛋白质；所述脯氨酸脱氢酶可为下述K1)或K2)的蛋白质：K1)氨基酸序列为SEQ ID No.8的蛋白质；K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述脯氨酸脱氢酶功能的由K1)衍生的蛋白质；所述异柠檬酸裂解酶可为下述L1)或L2)的蛋白质：L1)氨基酸序列为SEQ ID No.9的蛋白质；L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述异柠檬酸裂解酶功能的由L1)衍生的蛋白质；所述丙酮酸氧化酶可为下述M1)或M2)的蛋白质：M1)氨基酸序列为SEQ ID No.10的蛋白质；M2)在SEQ ID No.10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由M1)衍生的蛋白质；所述乙酰辅酶A合成酶可为下述N1)或N2)的蛋白质：N1)氨基酸序列为SEQ ID No.11的蛋白质；N2)在SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述乙酰辅酶A合成酶功能的由N1)衍生的蛋白质。上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因可为下述G11)-G13)中的任一种DNA分子：G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；所述谷氨酸-5-激酶基因可为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因可为下述I11)-I13)中的任一种DNA分子：I本文档来自技高网...

【技术保护点】
反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进行反应得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸；所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造得到重组细胞的步骤：A1)向所述受体细胞中导入L‑脯氨酸‑4‑羟化酶基因；A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸‑5‑激酶基因；A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸‑5‑半醛脱氢酶基因；A4)为如下B1)、B2)、B3)和B4)这四种中的任一种、任两种、任三种或四种：B1)将所述受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除；B2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶基因敲除；B3)为如下B31)和B32)：B31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶基因敲除；B32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶A合成酶基因；B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶基因敲除；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

【技术特征摘要】
2015.04.29 CN 20151021227941.反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法，包括利用重组细胞与底物进行反应得到反式-4-羟基-L-脯氨酸；所述重组细胞的构建方法，包括对受体细胞进行A1)、A2)、A3)和A4)的改造得到重组细胞的步骤：A1)向所述受体细胞中导入L-脯氨酸-4-羟化酶基因；A2)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-激酶基因；A3)向所述受体细胞中导入谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因；A4)为如下B1)、B2)、B3)和B4)这四种中的任一种、任两种、任三种或四种：B1)将所述受体细胞的α－酮戊二酸脱氢酶基因敲除；B2)将所述受体细胞的异柠檬酸裂解酶基因敲除；B3)为如下B31)和B32)：B31)将所述受体细胞的丙酮酸氧化酶基因敲除；B32)向所述受体细胞中导入乙酰辅酶A合成酶基因；B4)将所述受体细胞的脯氨酸脱氢酶基因敲除；所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述受体细胞为大肠杆菌。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述底物为谷氨酸或/和可溶性谷氨酸盐。4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述L-脯氨酸-4-羟化酶是如下G1)或G2)的蛋白质：G1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；G2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羟化酶功能的由G1)衍生的蛋白质；所述谷氨酸-5-激酶是下述H1)或H2)的蛋白质：H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质；H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由H1)衍生的蛋白质；所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶是下述I 1)或I2)的蛋白质：I1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的蛋白质；I2)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶功能的由I 1)衍生的蛋白质；所述α－酮戊二酸脱氢酶是下述J1)或J2)的蛋白质：J1)氨基酸序列为SEQ ID No.7的蛋白质；J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述α－酮戊二酸脱氢酶功能的由J1)衍生的蛋白质；所述脯氨酸脱氢酶是下述K1)或K2)的蛋白质：K1)氨基酸序列为SEQ ID No.8的蛋白质；K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述脯氨酸脱氢酶功能的由K1)衍生的蛋白质；所述异柠檬酸裂解酶是下述L1)或L2)的蛋白质：L1)氨基酸序列为SEQ ID No.9的蛋白质；L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述异柠檬酸裂解酶功能的由L1)衍生的蛋白质；所述丙酮酸氧化酶是下述M1)或M2)的蛋白质：M1)氨基酸序列为SEQ ID No.10的蛋白质；M2)在SEQ ID No.10所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由M1)衍生的蛋白质；所述乙酰辅酶A合成酶是下述N1)或N2)的蛋白质：N1)氨基酸序列为SEQ ID No.11的蛋白质；N2)在SEQ ID No.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述乙酰辅酶A合成酶功能的由N1)衍生的蛋白质。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因为下述G11)-G13)中的任一种DNA分子：G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述L-脯氨酸-4-羟化酶的cDNA分子或基因组DNA；所述谷氨酸-5-激酶基因为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因组DNA；所述谷氨酸-5-半醛脱氢酶基因为下述I 11)-I 13)中的任一种DNA分子：I11)编码序...

【专利技术属性】
技术研发人员：林白雪，崔丽，袁慎键，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11