一种基于Au‑GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种基于Au‑GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Au‑GQD@PtPd作为检测抗体标记物，制备一种癌胚抗原的夹心型电化学免疫传感器，利用Au‑GQD@PtPd优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Au-GQD@PtPd作为检测抗体标记物，制备一种夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料、免疫分析以及生物传感检测

技术介绍
人类受众多疾病的困扰，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌和囊腺癌，发病率高、生长和转移速度快，对人类的健康有极大的危害。癌胚抗原最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，人体血清中癌胚抗原的含量的升高，表明人体处于一种非健康的状态。癌胚抗原的意义就在于其能反映出多种肿瘤的存在，可用于对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计。癌胚抗原升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。因此在临床研究上，发展快速、简便、灵敏的检测癌胚抗原的方法十分重要。目前已有的对于癌胚抗原的检测方法很多，如目前常用于检测癌胚抗原的免疫分析方法主要包括有放射免疫法、酶联免疫分析方法、荧光免疫分析方法和电化学发光免疫分析方法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，使得它具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。电沉积金具有良好的导电性能，其优良的生物相容性使之能够很好的固载抗体，有序介孔碳以其大的比表面积能够很好的固载金纳米粒子和铬离子，使之具有良好的催化性能，能够加速电子传递，对于提高传感器灵敏度具有重要作用。因此本专利技术制备了一种应用电沉积金作为基底材料和以Au-GQD@PtPd为标记物的免疫传感器，实现了对癌胚抗原的超灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是基于Au-GQD@PtPd作为检测抗体标记物，构建了一种快速超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。本专利技术的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于癌胚抗原的检测。本专利技术的技术方案如下：1. 一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将HAuCl4 (1 wt%)用计时电流法从-0.2V~0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；（3）滴涂6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 µL、1×10-6 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；（6）将6µL、1.5 ~ 5.0 mg/mL的检测抗体孵化物Au-GQD@PtPd-Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Au-GQD@PtPd的癌胚抗原传感器。2. 如权利要求1所述的一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法，所述的所述Au-GQD@PtPd -Ab2二抗孵化物溶液的制备，其特征在于，制备步骤如下：（1）石墨烯量子点的制备 首先将2.0 g 柠檬酸和1.0 g 双氰胺加入到5mL超纯水中，之后将混合物转移到25 mL高压釜内加热到180℃并持续12 h；将产物分散在100 mL超纯水中，在离心机中用10000 r/min的转速离心10 min，取上清液室温下真空干燥12 h，制得石墨烯量子点；（2）GQD@PtPd的制备将0.158 mL氯铂酸（20mmol/L）, 0.233 mL氯钯酸（20mmol/L）和20mg 石墨烯量子点在磁力搅拌下加入到15.0 mL超纯水中，用NaOH调节pH到10，随后把混合溶液转移至高压反应釜中，在160℃下反应6h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，室温下真空干燥12 h，制得黑色粉末GQD@PtPd；（3）金纳米粒子的制备 将1.0 mL 氯金酸（1 wt%）加入到99 mL超纯水中，边搅拌边加入2.5 mL的柠檬酸钠（1 wt%），在100 oC下回流15 min，离心分离，弃去沉淀，分散均匀的酒红色的上清液即为金纳米粒子种子溶液；取1 mL 金纳米粒子种子溶液与25 mL 二次水与混合均匀，加入100 μL、 0.2 mol/L的盐酸羟胺溶液，在室温下高速搅拌混匀，然后逐滴加入3.0 mL氯金酸（1 wt%）溶液，随着氯金酸的加入，溶液的颜色逐渐转变为深红色，制得粒径为50±5 nm的金纳米粒子溶液；（4）Au-GQD@PtPd的制备首先将1.0 mL金纳米粒子溶液和2.0 mL乙二胺分散在5.0 mL超纯水中，超声1h，然后磁力搅拌5h，离心分离，并用超纯水洗涤，弃上清液，得到氨基功能化的金纳米粒子，然后准确加入4~6 mg GQD@PtPd，并加入1.0 mL超纯水，室温反应12h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，35oC真空干燥，制得Au-GQD@PtPd；（5）检测抗体孵化物Au-GQD@PtPd -Ab2溶液的制备将1.5~5 mg的Au-GQD@PtPd二抗标记物分散到1 mL超纯水中，加入100 μL、80~120 μg/mL的肿瘤标志物二抗Ab2溶液和900 μL、50 mmol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入1 mL 50 mmol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液，得到检测抗体孵化物Au-GQD@PtPd -Ab2溶液，4℃下保存备用。3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器用于癌胚抗原的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.91 ~ 8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用计时电流法对癌胚抗原进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间400 s；（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中加入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。4.如权利要求1所述的一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法，所述癌胚抗原选自CEA。本专利技术的有益成果（1）本专利技术的专利技术人首次将Au-GQD@PtPd纳米粒子作为检测抗体标记物引入到癌胚抗原的电化学免疫传感器的制备当中，利用Au-GQD@PtPd优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器具有高的灵敏度和宽的检测范围，检测CEA线性范围为0.001 pg/mL～10 ng/mL，检测限为0.0003 pg/mL。（2）使用了具有良好催化效果电沉积金作为基底材料，既能够很好的固载捕获抗体，又可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Au‑GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将HAuCl4 (1 wt%)用计时电流法从‑0.2V~0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；（3）滴涂6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 µL、1×10‑6 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；（6）将6µL、1.5 ~ 5.0 mg/mL的检测抗体孵化物Au‑GQD@PtPd‑Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Au‑GQD@PtPd的癌胚抗原传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3~5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将HAuCl4 (1 wt%)用计时电流法从-0.2V~0.2V电沉积到电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；（3）滴涂6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物一抗Ab1溶液于电极表面， 4oC冰箱中干燥；（4）超纯水冲洗掉未结合的捕获抗体Ab1后，滴加3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，4oC冰箱中晾干；（5）超纯水冲洗掉未结合的BSA后，滴加6 µL、1×10-6 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原溶液，室温孵化1h，超纯水清洗， 置于4oC冰箱中干燥；（6）将6µL、1.5 ~ 5.0 mg/mL的检测抗体孵化物Au-GQD@PtPd-Ab2溶液滴涂于电极表面上，室温孵化1h，超纯水清洗干净，置于4oC冰箱中晾干，制得一种基于Au-GQD@PtPd的癌胚抗原传感器。2.如权利要求1所述的一种基于Au-GQD@PtPd的免疫传感器的制备方法，所述的所述Au-GQD@PtPd -Ab2二抗孵化物溶液的制备，其特征在于，制备步骤如下：（1）石墨烯量子点的制备 首先将2.0 g 柠檬酸和1.0 g 双氰胺加入到5mL超纯水中，之后将混合物转移到25 mL高压釜内加热到180℃并持续12 h；将产物分散在100 mL超纯水中，在离心机中用10000 r/min的转速离心10 min，取上清液室温下真空干燥12 h，制得石墨烯量子点；（2）GQD@PtPd的制备将0.158 mL氯铂酸（20mmol/L）, 0.233 mL氯钯酸（20mmol/L）和20mg 石墨烯量子点在磁力搅拌下加入到15.0 mL超纯水中，用NaOH调节pH到10，随后把混合溶液转移至高压反应釜中，在160℃下反应6h，离心分离，并用超纯水洗涤，直至上清液无色，室温下真空干燥12 h，制得黑色粉末GQD@PtPd；（3）金纳米粒子的制备将1.0 mL 氯金酸（1 wt%）加入到99 mL超纯水中，边搅拌边加入2.5 mL的柠檬酸钠（1 wt%），在100 o...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青，杨玉莹，董云会，刘会，王平，李月云，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东;37