一组DNA分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用，包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因78D2，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:6所示。该重组菌能高效表达全基因优化的糖基转移酶基因op78D2，该酶能高效、特异性的在山萘酚3位羟基进行糖基化；同时通过强化重组菌UDP‑glucose的合成途径，使重组菌能高效供应UDP‑glucose，解除重组菌合成紫云英苷的瓶颈。最终通过发酵条件的优化，实现了紫云英苷的高效合成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一组DNA分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用。
技术介绍
紫云英苷是一种黄酮类化合物，存在于多种植物中。如荷叶，桑叶，天山花楸叶，维药属葵花等。紫云英苷化学学名为3,5,7,4’-四羟基黄酮-3-葡萄糖苷，分子式为C21H20O11，相对分子量为448.38，其分子结构式如图-1所示。具有显著的抗氧化活性、抗炎活性、抗过敏性、调节机体免疫力等多种药理作用。抗炎作用：紫云英苷能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞NO、PGE2和IL-6或TNF-α的产生；研究表明紫云英苷能够降低牙龈卟啉单胞菌囊诱导的人牙龈上皮细胞促炎性因子COX-2、IL-6、IL-8、MMP-1和MMP-3的基因表达水平，表明其是一种潜在慢性牙周炎治疗药物。抗过敏作用：有报道显示紫云英苷对过敏性疾病如过敏性皮炎具有很好的治疗作用。Matsumoto等通过口服给药过敏性皮炎小鼠，发现紫云英苷可以减轻其皮炎症状，并减少表皮水分流失。Kotani等研究发现紫云英苷可以抑制高亲和力IgE受体交联的人嗜碱白血病细胞(KU812)组胺释放水平，减弱小鼠被动皮肤过敏反应和皮肤炎症反应，减少炎性细胞如肥大细胞浸润，下调血液中IgE水平和脾脏T淋巴细胞对IL-4和IL-13分泌。抗氧化作用：一直以来黄酮类化合物被广泛地用作抗氧化剂使用。它能够有效地清除活性氧自由基，并且和过氧自由基作用来终止多不饱和脂肪酸自氧化过程中的自由基链反应。Park等证实紫云英苷能够对抗活性氧自由基，保护细胞膜免受太阳照射引起的皮肤损伤。张银娣等研究发现紫云英苷具有抗远志皂苷引起的溶血作用和抗CCl4肝毒作用，同时增强小鼠红细胞内超氧歧化酶(SOD)活性，降低小鼠肝内丙二醛(MDA)和增加谷胱甘肽(GSH)含量。Choi等研究发现紫云英苷可以有效阻止人红细胞自由基(AAPH)诱导的氧化溶血和胞内抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)衰竭。Saito等通过高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)发现紫云英苷的清除自由基能力与其和G-C碱基对之间形成氢键来加固其与DNA之间的嵌合能力有关。Kovganko等研究发现紫云英苷可以保护PBS溶液中过氧化氢酶不被超声裂解，保护效果优于没食子酸丙酯和4-叔丁基儿茶酚。免疫调节作用：紫云英苷是增强机体免疫能力的一种有效成分。尤丽芬等研究表明适当浓度的紫云英苷(5μg～0.05μg/mL)对人外周血NK细胞活性具有显著的促进作用，其作用强弱与机体的免疫水平有关。张银娣等研究发现紫云英苷能够对抗环磷酰胺(Cyclophosphamide)、60CO-γ射线引起的末梢血液中白细胞减少和升高氢化可的松(Hydr℃ortisone)免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞，增重脾脏和显著提高小鼠遭受应激如寒冷、高温、缺氧时的耐力。目前紫云英苷主要从桑叶、仙草等通过有机溶剂提取得到粗提物，再通过柱层析、结晶等方法获得纯品。但由于紫云英苷在植物中的含量比较低，同时植物中含有多种黄酮类化合物成分复杂，造成提取成本过高，环境污染等缺点。近年来发展起来的合成生物学为天然产物的合成提供了更好的解决方案。植物中存在紫云英苷的合成途径，如果能够在异源构建紫云英苷的高效合成途径，将有望解决高效获得紫云英苷的技术瓶颈。植物合成紫云英苷是以山奈酚为底物通过糖基转移酶以二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-glucose)为葡萄糖供体合成紫云英苷。在异源宿主中实现紫云英苷的高效合成，首先需要获得能高效、特异性催化山奈酚生成紫云英苷的转糖基酶；其次需要宿主能高效供应UDP-glucose。本专利技术对拟南芥、银杏、芽孢杆菌来源的5种糖基转移酶合成紫云英苷的能力进行了比较，筛选获得了拟南芥糖基转移酶基因78D2，该酶能高效转化山奈酚生成紫云英苷，以山奈酚为底物时，其Km和Vmax为0.3mM和27U/mg。对该酶基因按照大肠杆菌优势密码子优化，并利用强启动子在大肠杆菌中实习了高效表达。另一方面，通过在重组菌中强化UDP-glucose的合成途径，实现了UDP-glucose的高效供应，进一步提高了紫云英苷的产量。在此基础上，对重组菌的发酵工艺进行了优化，获得了重组菌产紫云英苷的最佳发酵条件，紫云英苷的产量达到2381mg/L，摩尔转化率为95％。通过HPD400大孔树脂层析柱分离，真空干燥得到纯度为97％的紫云英苷精制品，紫云英苷的得率为85％。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供了一组DNA分子及其重组质粒和重组大肠杆菌及其产紫云英苷的应用，该重组菌能高效表达全基因优化的糖基转移酶基因op78D2，该酶能高效、特异性的在山萘酚3位羟基进行糖基化；同时通过强化重组菌UDP-glucose的合成途径，使重组菌能高效供应UDP-glucose，解除重组菌合成紫云英苷的瓶颈。最终通过发酵条件的优化，实现了紫云英苷的高效合成。技术方案:一组DNA分子，包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因78D2，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:6所示。含有上述DNA分子的一对重组质粒，拟南芥糖基转移酶基因78D2是以pGEX-2T为载体，构建重组质粒pGEX-op78D2进行表达，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB是以pACYCDuet-1为载体，构建重组质粒pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA进行表达。pGEX-op78D2的构建方法为：按照SEQ ID NO:1设计引物，78D2-1：CCCGGATCCATGACTAAACCGTCTGACCC和78D2-2：CCCGAATTCTTAGATGATGTTAACCACCGC；以SEQ ID NO:1为模板，用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1.2min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温；通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，得到糖基转移酶基因op78D2和pGEX-2T分别用BamH I和EcoR I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-op78D2。pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA的构建方法为：第一轮PCR，以E.coli W的基因组为模板，用合成的引物cscB-12：CCACAAATCAAATCAGAAGAGTATTGCTAATGGCACTGAATATTCCATT和cscB-2：CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1.5min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温，通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；第二轮PCR，以上述P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组DNA分子，其特征在于包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因78D2，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:6所示。
【技术特征摘要】
1.一组DNA分子，其特征在于包括经优化的拟南芥糖基转移酶基因78D2，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:6所示。2.含有权利要求1所述DNA分子的一对重组质粒，其特征在于拟南芥糖基转移酶基因78D2是以pGEX-2T为载体，构建重组质粒pGEX-op78D2进行表达，蔗糖磷酸化酶基因Basp，尿苷酰转移酶基因ugpA和蔗糖透性酶基因cscB是以pACYCDuet-1为载体，构建重组质粒pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA进行表达。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于pGEX-op78D2的构建方法为：按照SEQ ID NO:1设计引物，78D2-1：CCCGGATCCATGACTAAACCGTCTGACCC和78D2-2：CCCGAATTCTTAGATGATGTTAACCACCGC；以SEQ ID NO:1为模板，用合成的引物进行PCR，扩增的条件是95℃，5 min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40 μL石蜡油密封；35次循环（ 94℃，50 s；51℃，90 s；72℃，1.2 min ）；72℃，10 min；反应停止，4℃保温；通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化，得到糖基转移酶基因op78D2和pGEX-2T分别用BamHI和EcoRI进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pGEX-op78D2。4.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于pACYCDuet-cscB-Basp-UgpA的构建方法为：第一轮PCR，以E. coli W的基因组为模板，用合成的引物cscB-12：CCACAAATCAAATCAGAAGAGTATTGCTAATGGCACTGAATATTCCATT 和cscB-2：CCCCCTGCATTAGGCCGGTTGAGGGATATAGAGC进行PCR，扩增的条件是95℃，5 min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40 μL石蜡油密封；35次循环（ 94℃，50 s；51℃，90 s；72℃，1.5 min ）；72℃，10 min；反应停止，4℃保温，通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化；第二轮PCR，以上述PCR片段为模板，用合成的引物cscB-11：CCCCCTGCATTAGGACCTATTGACAATTAAAGGCTAAAATGCTATAA...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴建军，董萍，赵林果，解静聪，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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