本发明专利技术公开了一种利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明专利技术从青蒿中克隆大根香叶烯合成酶GAS基因，构建含反义GAS(anti‑GAS)基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将anti‑GAS基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源anti‑GAS基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明专利技术获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的1.7倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
技术介绍
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。青蒿素主要来源于青蒿植株的地上部分，且大部分青蒿素在叶片中，然而青蒿中青蒿素的含量非常低,仅占植株干重的0.01-0.8％，由于发展中国家对青蒿素的需求量巨大，人工种植获得的青蒿素远远不能满足市场的需要，使得该药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。经对现有技术文献检索发现，Ling Zhang等在《Biotechnology and Applied Biochemistry》(《生物技术和应用生物化学》，2009年52卷3期199-207页)发表了题为“Development of transgenic Artemisia annua(Chinese wormwood)plants with an enhanced content of artemisinin,an effective anti‐malarial drug,by hairpin-RNA-mediated gene silencing”(“通过RNAi技术提高青蒿素的含量”)的论文，报道通过利用RNAi技术沉默青蒿素代谢途径支路基因角鲨烯合酶(squalene synthase，SQS)，使转基因青蒿中青蒿素的含量提高了3.14倍，达到干重的31.4mg/g。通过抑制代谢支路基因为提高青蒿素的含量提供了一条可行的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用反义GAS基因(anti-GAS基因)提高青蒿中青蒿素含量的方法。本专利技术涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本专利技术，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术涉及一种青蒿素含量提高的转基因青蒿植株，所述转基因青蒿植株导入了反义GAS基因；所述反义GAS基因的序列为SEQ ID NO:1所示序列经反向互补而得。本专利技术还涉及一种利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括如下步骤：S1、从青蒿中克隆大根香叶烯合成酶基因GAS(即，青蒿素合成竞争支路途径关键酶基因)；S2、把GAS基因可操作性地反向连结于表达调控序列，构建含anti-GAS基因的植物表达载体；S3、将所述含anti-GAS基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含anti-GAS基因植物表达载体的根癌农杆菌；S4、利用所述含anti-GAS基因植物表达载体的根癌农杆菌转化青蒿，获得经PCR检测外源目的基因anti-GAS的转基因青蒿植株。优选的，步骤S1中，所述克隆包括以下步骤：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA,以所述第一链cDNA为模板，采用如SEQ ID NO：2示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物进行PCR扩增后测序。优选的，步骤S2中，所述反向连结包括以下步骤：选择克隆得到的GAS基因序列前312bp作为反义的片段；在GAS上游引物前加酶切位点BstEⅡ、下游引物加酶切位点BglⅡ，将所述反义的片段连接到PMD18T上；其中，含酶切位点BstEⅡ的上游引物的序列如SEQ ID NO：4所示，含酶切位点BglⅡ的下游引物的序列如SEQ ID NO：5所示。优选的，步骤S2中，所述构建包括如下步骤：BstEⅡ/BglⅡ双酶切中间载体PMD18T-GAS和表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos，回收GAS和pCAMBIA2300::p35S--nos大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证；所述连接转化中GAS经过的连接反应是反向连接。优选的，步骤S4中，所述转化包括外植体的预培养、农杆菌与外植体的共培养和抗性再生青蒿植株的筛选；所述筛选具体为：将共培养后的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得潮霉素(Hyg)抗性丛生芽；将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得抗性再生青蒿植株。优选的，所述发芽筛选培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+潮霉素50mg/L+Cb 500mg/L；所述生根培养基为1/2MS+Cb 125mg/L。优选的，步骤S4中，所述PCR检测包括：设计合成anti-GAS基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株。优选的，所述anti-GAS基因的检测引物的序列包括如SEQ ID NO：5所示的上游引物和如SEQ ID NO：6所示的下游引物。优选的，所述方法还包括对所述转基因青蒿植株中青蒿素含量进行高效液相色谱法及蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株的步骤；所述HPLC-ELSD测定包括以下条件：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇:水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的转anti-GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将青蒿素代谢竞争支路基因GAS以反义的方式导入青蒿植株中，从而抑制青蒿素合成途径竞争支路，促使代谢流更多地流向青蒿素合成途径，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系，转anti-GAS基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到12.3mg/g DW，是非转化普通青蒿(7.3mg/g DW)的1.7倍，该专利技术对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为转基因青蒿植株的PCR检测示意图；图2为转基因青蒿植株的青蒿素含量比较示意图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青蒿素含量提高的转基因青蒿植株，其特征在于，所述转基因青蒿植株导入了反义GAS基因；所述反义GAS基因的序列为SEQ ID NO：1所示序列经反向互补而得。
【技术特征摘要】
1.一种青蒿素含量提高的转基因青蒿植株，其特征在于，所述转基因青蒿植株导入了反义GAS基因；所述反义GAS基因的序列为SEQ ID NO：1所示序列经反向互补而得。2.一种利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、从青蒿中克隆大根香叶烯合成酶基因GAS；S2、把GAS基因可操作性地反向连结于表达调控序列，构建含anti-GAS基因的植物表达载体；S3、将所述含anti-GAS基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含anti-GAS基因植物表达载体的根癌农杆菌；S4、利用所述含anti-GAS基因植物表达载体的根癌农杆菌转化青蒿，获得经PCR检测外源目的基因anti-GAS的转基因青蒿植株。3.根据权利要求2所述的利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤S1中，所述克隆包括以下步骤：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，以所述第一链cDNA为模板，采用如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物进行PCR扩增后测序。4.根据权利要求2所述的利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述反向连结包括以下步骤：选择克隆得到的GAS基因序列前312bp作为反义的片段；在GAS上游引物前加酶切位点BstE II、下游引物加酶切位点Bgl II，将所述反义的片段连接到PMD18T上；其中，含酶切位点BstE II的上游引物的序列如SEQ ID NO：4所示，含酶切位点Bgl II的下游引物的序列如SEQ ID NO：5所示。5.根据权利要求2所述的利用反义GAS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，步骤S2中，所述构建包括如下步骤：BstE II/Bgl II双酶切中间载体PMD18T-GAS和表达载体pCAMBIA2300：：p35S-gus-nos，回收GAS和pCAMBIA2300：：p35S-nos大...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，吕宗友，王玉亮，孙小芬，
申请(专利权)人：苏州唐基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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