本发明专利技术涉及一种核苷酸序列及其用途，具体涉及将IL‑2的cDNA序列和LMP2A的cDNA序列融合、优化后获得的核苷酸序列，本发明专利技术获得活体疫苗的以病毒基因及基因产物为靶点，利用EBV阳性肿瘤细胞与正常细胞的差异，选择性地杀伤肿瘤细胞，为病毒相关肿瘤的特异性治疗提供了新的方法和实验基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种核苷酸序列及其用途，属于分子生物
技术介绍
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是1964年Epstein和Barr在研究非洲儿童的恶性淋巴瘤时，从瘤细胞培养中发现的一种嗜人类淋巴细胞的γ疱疹病毒，基因组全长184kb。目前可感染人类的EBV有两种亚型：EBV-1和EBV-2，其区别在于编码核抗原的基因构成不同。EBV可引起两种不同类型的感染，一种是增殖性感染，另一种是非增殖性感染，在一定条件下或某些诱导因子的作用下，潜伏的EBV基因组可被激活而转化为增殖性感染。此外，受EBV感染和转化的宿主细胞在不断的分裂和增殖过程中如果受到某些辅助因子的促发，个别细胞可发生染色体易位等异常，从而导致细胞转化为恶性增殖。目前研究发现EBV感染与多种人类肿瘤发生相关，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等，认为EBV在这些肿瘤发生中起到相当重要的作用，因此在1997年IARC(International Agency for Research on Cancer)已经把EBV归为第一类致癌因素。因此，研制安全有效的EB病毒疫苗，从而预防该病毒引起的诸多疾病及肿瘤的发生已成为当务之急。由于EBV的潜在致癌性，EBV减毒活疫苗不适合对健康人预防，在EBV亚单位疫苗基础上开展的疫苗研究已成为国内外研究的热点，但至今没有EB病毒亚单位疫苗的报导。近年来研究表明体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中均有潜伏膜蛋白基因LMP2A表达，研究证实约50％的EBV相关胃癌LMP2A阳性，而且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等肿瘤细胞稳定表达的少数EBV保守抗原之一，具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用。LMP2A可成为EBV相关肿瘤免疫治疗的理想靶抗原，如果把该基因单独或者联合转入表达载体，则可能表达这种靶抗原，诱导机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫，预防EBV感染以及杀伤EBV阳性肿瘤细胞。白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种细胞因子信使蛋白，其cDNA为462bp，其首次发现是作为T细胞增殖因子，从有丝分裂原刺激培养的淋巴细胞中纯化出来。IL-2可以激活部分免疫系统，通过刺激免疫系统血细胞的生长来调节炎症和免疫反应，除了能刺激T细胞增殖外，它还可以增强NK细胞的功能，激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，可促进辅助性T淋巴细胞(CD4+T)的增殖。IL-2是一种理想的治疗癌症的细胞因子。目前被认为是调节T细胞反应的重要细胞因子，可以调节T细胞活化、扩张和死亡，促进记忆性T细胞在多种细胞因子及受体信号中持续表达，IL-2还能促进NK细胞、CD8+T细胞和LAK细胞的有丝分裂，增加荷瘤器官内效应细胞的数量和杀伤肿瘤的活性，同时并不刺激正常细胞的增殖。IL-2也对其它一些免疫细胞，包括B细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等都有影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种核苷酸序列及其用途，具体涉及将IL-2的cDNA序列和LMP2A的cDNA序列融合、优化后获得的核苷酸序列，以及该序列在制备预防和治疗EB病毒阳性肿瘤药物中应用。本专利技术核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该核苷酸序列是由IL-2的cDNA序列、LMP2A的cDNA序列以及融合片段组成，IL-2的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，LMP2A的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，融合片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本专利技术核苷酸序列具体合成过程如下：以IL-2的cDNA为模板，上游引物F1，下游重叠引物F2，进行PCR扩增，PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；变性-退火-延伸过程进行30个循环，最后72℃延长10min。获得IL-2片段，F1的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，F2的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；以LMP2A的cDNA为模板，上游重叠引物F3，下游引物F4，进行PCR扩增，PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min；变性-退火-延伸过程进行40个循环，最后72℃延长10min。获得LMP2A片段，F3的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，F4的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。将IL-2片段和LMP2A片段用T4DNA连接酶连接后，用引物F1和引物F4进行PCR扩增，获得融合基因LMPI-2；PCR扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min；变性-退火-延伸过程进行40个循环，最后72℃延长10min。获得的融合基因LMPI-2，5’端比IL-2多出8个碱基“GAGAATTC”，3’端比LMP2A多出8个碱基“GTCGACGC”。本专利技术中，还包括含有核苷酸序列SEQ ID No.1的质粒或者活体疫苗，以及由核苷酸序列SEQ ID No.1的编码的蛋白。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：本专利技术获得活体疫苗的以病毒基因及基因产物为靶点，利用EBV阳性肿瘤细胞与正常细胞的差异，选择性地杀伤肿瘤细胞，为病毒相关肿瘤的特异性治疗提供了新的方法和实验基础。附图说明图1为rBCG对EBV阳性肿瘤的治疗作用图其中，A.疫苗治疗组；B.BCG对照组；图2为rBCG免疫小鼠肿瘤组织浸润淋巴细胞图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1核苷酸序列SEQ ID No.1的合成过程核苷酸序列SEQ ID No.1是由IL-2的cDNA序列、LMP2A的cDNA序列以及融合片段组成，IL-2的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，LMP2A的cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，融合片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本专利技术核苷酸序列具体合成过程如下：以IL-2的cDNA为模板，上游引物F1，下游重叠引物F2，进行PCR扩增，95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸2min；变性-退火-延伸过程进行60个循环，最后72℃延长10min。获得IL-2片段，F1的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，F2的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；以LMP2A的cDNA为模板，上游重叠引物F3，下游引物F4，进行PCR扩增，获得LMP2A片段，F3的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，F4的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。将IL-2片段和LMP2A片段用T4DNA连接酶连接后，用引物F1和引物F4进行PCR扩增，获得融合基因LMPI-2；PCR扩增条件：94℃预变性1min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min；变性-退火-延伸过程进行40个循环，最后72℃延长10min。实施例2融合基因LMPI-2与质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID No.1。
【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID No.1。2.含有如权利要求1所述核苷酸序列SEQ ID No.1的质粒。3.含有如权利要求1所述核苷酸序列SEQ ID No.1的活体疫苗。4.如权利要求1所述核苷酸序列中的融合片段SEQ ID No.4。5.合成如权利要求1所述核苷酸序列时用的引物，其特征在于，F1的核苷酸序列为SEQ I...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛庆节，闫迎春，李运清，吕厚东，陈廷，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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