基于2D和3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法技术

基于2D和3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，属于微生物的测定或检验方法技术领域，包括如下步骤：1）2D细胞培养；2）3D细胞培养；3）细胞传代；4）将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中备用；5）进行纳米材料表征和细胞形态学观察，采用MTT比色法检测细胞活性，对炎症因子白细胞介素‑8进行检测，借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式；使用SPSS19.0统计软件进行分析，对数据进行单因素方差分析，计算p<0.05和p<0.01的差异显著性。本发明专利技术评估了在2D和3D细胞培养模型中纳米氧化锌对细胞的生物学效应以及对纳米氧化锌毒性。这些研究对于体外探讨纳米氧化锌的肠毒性具有一定的理论意义，并为纳米氧化锌限量标准的制定提供参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物的测定或检验方法
，具体涉及为基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法。
技术介绍
目前，纳米材料对环境和人类健康影响的研究还不完善，相关的信息比较少。与常规食品材料相比，纳米食品材料粒径较小，与其在理化性质上的差异较大，并且纳米材料在机体内的生物活性，以及产生的生物正副效应均得到放大，诱导的细胞毒性也可能会增强。因此，需要大量科学的毒理学权威信息，解释什么剂量范围内是危险的，什么剂量范围内是安全的。在众多的金属纳米材料中，纳米氧化锌是被广泛应用的材料之一。纳米氧化锌是一种粒径在 1～100nm 的新型高功能精细无机材料。与常规氧化锌相比，纳米氧化锌具有极强的抗氧化性、抗腐蚀性、光催化性和独特的抗紫外线性，使其在光电学、橡胶工业、涂料陶瓷、化妆品、食品添加剂、生物医学等方面应用广泛，而且在光、声、电纳米器件等领域将有着广阔的应用前景。目前已知纳米氧化锌可通过皮肤接触、呼吸道、消化道和静脉注射等途径进入机体，但机体很难排除这类微小物质，因此潜在一定的毒性效应。物质被纳米化后，其毒性、吸收和排泄方式都有所改变。纳米氧化锌的细胞毒理学研究开展较为广泛，已证明纳米氧化锌对人肺腺癌细胞、人结肠癌细胞、人胚肺成纤维细胞和呼吸道上皮细胞等多种细胞系有毒性作用。细胞是大多数生物体的基本单位，其变化大体上可反映生物机体功能与结构的变化，而当机体功能与结构未发生变化时，细胞功能与结构也可能发生改变。细胞毒理学主要是应用体外细胞技术手段研究环境中物理、化学和生物等多种污染物对细胞的损伤效应与规律，从而获得该物质的细胞毒效应、与剂量有关的暴露特征（如暴露时间、暴露途径、暴露频率）、毒作用机理等诸多信息。以细胞为研究对象进行纳米颗粒生物效应研究，主要是应用体外培养的细胞株对纳米颗粒进行毒效应监测，评价纳米颗粒对人体可能产生的危害。一般测试方法是将传代细胞或原代细胞置于塑料培养皿，加入一定量的纳米材料，然后观察细胞反应。目前主要采用的细胞类型包括吞噬细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、红细胞和各种癌细胞。目前涉及的主要检测项目包括细胞毒性检测、细胞凋亡检测以及免疫细胞化学技术。追溯到上个世纪七十年代，各国科学家们意识到癌细胞生长的外环境对其表型形成是非常重要的。很多研究表明正常组织细胞以及癌细胞在传统二维（2D）塑料培养皿中培养会失去其原有的组织结构与表现，相比体内细胞往往会进行代谢、表型和基因表达的改变，这些改变会影响到癌细胞的发展和功能。Brinster等人发现将胚胎肿瘤细胞接种到小鼠皮下形成了胚胎癌，而将次细胞接种到已孕小鼠胚胎囊里则可以发育成小鼠，这个结果表明肿瘤细胞生长的微环境差异对其形成肿瘤的可能性影响很大。建立在这些理论基础上，Emerman、Elsdale以及Weaver等人提出可以利用再造细胞外基质（extracellular matrix，ECM）以构成网架结构并支持和连接组织结构来构建体外3D细胞培养模型。3D细胞培养定义为细胞、一些生长因子和再造基质蛋白以及骨架共培养，以模仿体内细胞生长环境的特性。通过模仿体内环境的特性，并利用传统的细胞培养研究工具，3D细胞培养提供了独特的视角来观察干细胞的行为、组织器官和肿瘤的发展过程。细胞在塑料培养皿的表面生长，即只能在二维（2D）平面上生长，但在体内，细胞则被其他细胞、组织和细胞外基质重重包围。以前科学家们从分子以及基因水平对体外2D细胞进行研究，以探索特定分子和基因改变对细胞生物学行为的影响。尽管体内动物模型更能准确地反映细胞的代谢、表型和基因表达，但实现大规模分子水平的研究也是非常困难的。建立体外3D培养模型将有助于跨越2D细胞培养与动物试验之间的鸿沟，因为3D细胞培养可以利用传统的2D细胞培养研究工具，并模拟体内状态提供细胞生长支架，综合了2D细胞培养和动物模型的优点。3D细胞培养可以模拟细胞生长的微环境，模拟体内细胞和细胞基质的相互作用，准确反映癌细胞和间质之间作用的机理。同时，3D细胞模型营造出的细胞微环境也更适合于诱导出细胞的极性，这对组织和其产品的直接分泌是很重要的。随着人们与纳米氧化锌接触的日益增多，其对人类健康的潜在毒性影响也引起了高度关注。研究纳米材料对细胞毒性的众多试验中，二维（2D）单层细胞培养仍然是占主导地位的体外模型。在传统2D塑料培养皿中培养的细胞会失去其原有的组织结构，极性以及蛋白质–蛋白质相互作用，而且相比体内模型往往会改变细胞的代谢、表型以及基因表达。当二维细胞培养模型扩展到纳米毒理学研究，它的这些限制有可能导致获得误导性结果和结论的风险。实际上在体内的所有细胞都生长在一个三维（3D）环境中，单个细胞的表型和功能是高度依赖于三维组织-细胞外基质（ECM）蛋白和邻近细胞的复杂相互作用。因此，在一个高度模拟体内生理环境的体外3D模型中进行纳米粒子的毒性研究可以为纳米材料的生物安全性评价提供更多理论基础和参考价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述提到的缺陷和不足，而提供基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法。本专利技术实现其目的采用的技术方案如下。基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：1）2D细胞培养：将Caco-2 细胞株加入含10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2 静置培养，每隔2~3天换一次细胞培养液，取对数生长期细胞进行后续试验；2）3D细胞培养：在试验前将无菌离心管分装的Matrigel胶置于冰上溶解2~3 h，再将移液器枪头和96孔培养板置于冰上冷却1 h；取10~20 μL Matrigel胶均匀的包埋细胞培养板底部，置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；消化二维细胞，计数并稀释至2 x 104/mL，分别吸取50 μL细胞悬液和Matrigel胶，按1:1混匀后转入96孔培养板，再置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；重新凝固的胶上层滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基，在条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中静置培养，每隔2~3天换一次完全DMEM培养基；3）细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3-4 d，细胞生长至单层80%-95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养；4）将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度纳米氧化锌悬液；放入4 ℃冰箱中备用；每次使用前，需使用使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚，超声条件为：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；5）进行纳米材料表征和细胞形态学观察，采用MTT比色法检测细胞活性，对炎症因子白细胞介素-8（IL-8）进行检测，通过荧光显微镜观察AO/EB双染后的2D细胞死亡形态，借助流式细胞仪检测不本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于2D和3D的Caco‑2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：1）2D细胞培养：将Caco‑2 细胞株加入含10% FBS和1% L‑谷氨酰胺的完全DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2 静置培养，每隔2~3天换一次细胞培养液，取对数生长期细胞进行后续试验；2）3D细胞培养：在试验前将无菌离心管分装的Matrigel胶置于冰上溶解2~3 h，再将移液器枪头和96孔培养板置于冰上冷却1 h；取10~20 μL Matrigel胶均匀的包埋细胞培养板底部，置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；消化二维细胞，计数并稀释至2 x 104/mL，分别吸取50 μL细胞悬液和Matrigel胶，按1:1混匀后转入96孔培养板，再置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；重新凝固的胶上层滴加100 μL 含有10% FBS和1% L‑谷氨酰胺的完全DMEM培养基，在条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中静置培养，每隔2~3天换一次完全DMEM培养基；3）细胞传代：Caco‑2细胞贴壁生长，经过3‑4 d，细胞生长至单层80%‑95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3‑5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中培养3‑4 d后，进行下一次传代培养；4）将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度纳米氧化锌悬液；放入4 ℃冰箱中备用；每次使用前，需使用使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚，超声条件为：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；5）进行纳米材料表征和细胞形态学观察，采用MTT比色法检测细胞活性，对炎症因子白细胞介素‑8进行检测，通过荧光显微镜观察AO/EB双染后的2D细胞死亡形态，借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式；使用 SPSS19.0统计软件进行分析，对数据进行单因素方差分析，计算p<0.05和p<0.01的差异显著性。...

【技术特征摘要】
1.基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：1）2D细胞培养：将Caco-2 细胞株加入含10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2 静置培养，每隔2~3天换一次细胞培养液，取对数生长期细胞进行后续试验；2）3D细胞培养：在试验前将无菌离心管分装的Matrigel胶置于冰上溶解2~3 h，再将移液器枪头和96孔培养板置于冰上冷却1 h；取10~20 μL Matrigel胶均匀的包埋细胞培养板底部，置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；消化二维细胞，计数并稀释至2 x 104/mL，分别吸取50 μL细胞悬液和Matrigel胶，按1:1混匀后转入96孔培养板，再置于37 ℃细胞培养箱30 min使其凝固；重新凝固的胶上层滴加100 μL 含有10% FBS和1% L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基，在条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中静置培养，每隔2~3天换一次完全DMEM培养基；3）细胞传代：Caco-2细胞贴壁生长，经过3-4 d，细胞生长至单层80%-95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3-5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入条件为37 ℃、5% CO2的培养箱中培养3-4 d后，进行下一次传代培养；4）将纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度纳米氧化锌悬液；放入4 ℃冰箱中备用；每次使用前，需使用使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚，超声条件为：3 min，超3 s停2 s，功率300 w；5）进行纳米材料表征和细胞形态学观察，采用MTT比色法检测细胞活性，对炎症因子白细胞介素-8进行检测，通过荧光显微镜观察AO/EB双染后的2D细胞死亡形态，借助流式细胞仪检测不同的细胞死亡方式；使用 SPSS19.0统计软件进行分析，对数据进行单因素方差分析，计算p<0.05和p<0.01的差异显著性。2.如权利要求1所述的基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，步骤5）中，所述纳米材料表征，包括以下步骤：纳米颗粒由无水乙醇超声混悬，滴加到铜网上干燥透射电镜下镜检；采用马尔文粒径仪对纳米颗粒进行强度和粒径分布的分析。3.如权利要求1所述的基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，步骤5）中，所述细胞形态学观察，包括以下步骤：将2D和3D 培养条件下的Caco-2细胞，进行染毒处理，细胞分别与浓度为10和75 μg/mL的24 nm纳米氧化锌染毒溶液共培养12 h；孵育12 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态，并拍摄照片；对照组细胞是与无血清的DMEM培养基共培养。4.如权利要求1所述的基于2D和3D的Caco-2细胞对纳米氧化锌生物安全性的评价方法，其特征在于，步骤5）中，采用MTT比色法检测细胞活性，包括以下步骤：将2D和3D细胞进行染毒处理，即加入0， 10， 25， 50， 75， 100 μg/ml不同浓度的24， 56， 87 nm三种粒径纳米氧化锌染毒液与细胞共培养12 h；染毒时间结束后，PBS润洗2次，每孔加入0.05 mg/mL的MTT200 μL，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：关荣发，陶淼，叶子弘，吴知盼，王彦波，刘明启，吕飞，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33