本发明专利技术提供了一种重组溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其包含特异性针对在细胞(例如癌细胞)表面上存在的分子(蛋白、脂质或碳水化合物抗原决定簇)的非HSV配体，和插入到一个或多个HSV基因(优选地为HSV在正常(即，非癌性)细胞中复制所需的一个或多个HSV基因)座中的一个或多个拷贝的一种或多种microRNA靶序列。本发明专利技术进一步提供了包含创新的oHSV的原液和药物组合物，以及使用所述创新的oHSV杀灭肿瘤细胞的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本专利申请要求于2013年10月28日提交的美国临时专利申请61/896,497的优先权，其全部内容在此通过引用并入。关于联邦政府资助的研究与开发的声明本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的基金号CA119298、CA163205、CA175052、NS040923和DK044935下借助政府支持而进行的。政府在本专利技术中具有某些权利。专利技术背景即便应用现有的联合疗法，多形性胶质母细胞瘤(GBM)仍是一种致命性疾病。临床前研究表明具有复制能力的病毒载体(包括溶瘤性HSV(“oHSV”)载体)有望成为替代性的治疗方法，但其在患者的临床试验中治疗效果有限。实现载体安全性依赖于减毒载体突变,而该突变还可能会危害在肿瘤细胞中的裂解复制。专利技术概述本专利技术提供了一种具有肿瘤选择性扩增能力但未减毒的oHSV，其可通过结合再靶向肿瘤相关细胞表面受体的载体和由细胞microRNA(“miR”)导致的载体的复制抑制来实现，其中所述细胞microRNA在正常脑中高度表达而在肿瘤细胞中几乎是不存在的。miR反应性元件在裸鼠脑中阻碍载体的发病过程，而不妨碍在体外或异种脑肿瘤模型中的原代肿瘤细胞中的胞溶性载体复制。该新载体设计将提供一种更安全且更有效的载体平台，并可进一步开发以应用于患者肿瘤。附图若干视图的简要说明图1呈现了来自T124元件的有效性和特异性的实验结果的数据。将在3’UTR中包含T124(pfLuc-T124)或对照序列(pfLuc-Ctrl)的萤火虫荧光素酶(fLuc)表达质粒与海肾荧光素酶(prLuc)内参质粒共转染入在24小时前已经转染了合成的pre-miR-124或pre-miR-21的HEK293AD细胞中。48小时后测定荧光素酶活性。结果表示为根据rLuc活性进行标准化的fLuc活性的三次测定值的均值±标准偏差。具有统计学上显著性差异的数据对由相应P值(未配对t检验)下的方括号表示。图2呈现了来自胶质瘤细胞中病毒复制实验结果的数据。(A)载体图。亲本KOS-37BAC在病毒UL37和UL38基因之间包含loxP侧接的BAC序列、氯霉素抗性序列和lacZ序列(“BAC”)(Gierasch等人，2006)。如下阐明了用于生成KGBAC和KG4:T124BAC的修饰：gB:NT，gB基因中的增强病毒进入的双重突变；gC-eGFP，经由2A肽序列将完整gC ORF融合至GFP；ΔJoint，删除完整的内部重复区，包括1个拷贝的所述ICP4基因；ICP4:T124，将T124插入剩余的ICP4基因的3’UTR中。UL，病毒基因组的单一长片段；US，单一短片段。(B)T124对于培养中的来源于患者的胶质瘤细胞中病毒复制的作用。以0.01的MOI采用KG或KG4:T124病毒感染Gli68和GBM30细胞，并且一式三份进行平行实验。在感染后的指定时间点，收集细胞裂解物和上清液并在U2OS细胞上测定滴度。值为均值±标准偏差。(C)LV124感染的Gli68细胞中的MiR-124表达。在5cfu/细胞感染细胞，之后三天在含嘌呤霉素培养基中进行筛选，并收获总RNA提取物。对照RNA来自未感染的Gli68和U2OS细胞。通过qRT-PCR三重测定miR-124水平并根据RNU43的水平进行数据标准化。所显示的数据是相对于U2OS细胞增加的倍数±标准偏差。所有数据对间的P<0.05(未配对t检验)。(D)在miR-124转导和对照GBM30和Gli68细胞中的KG和KG4:T124病毒复制。用LV124或LV137R以5cfu/细胞感染细胞，采用嘌呤霉素筛选3天，并用KG或KG4:T124以0.01的MOI重复感染。在U2OS细胞上测定在感染后72小时和96小时收集的细胞裂解物和上清液中合并的感染性HSV的滴度。结果为来自三个HSV感染的平行实验的均值±标准偏差。方括号指示具有显著差异的数据对，同时示出了相应P值(未配对t检验)。图3呈现了来自裸鼠脑中KG4:T124病毒复制和毒性实验结果的数据。将4.8x109基因组拷贝的KG或KG4:T124颅内注射入各4只BALB/c裸鼠(n＝4/组)。(A)载体注射后的经时动物重量。左，注射KG的动物；X，动物死亡。右，注射KG4:T124的小鼠；实心圆，动物处死。(B)载体注射后鼠脑中的经时总病毒基因组拷贝。收集来自载体注射组的在第5、14、21和33天处死的单只KG4:T124注射小鼠和来自KG注射组的在第5天安乐死的具有严重疾病症状的最后存活动物的脑，分离DNA，通过qPCR测定每个脑中的病毒载体基因组总数。(C)本实验中动物的Kaplan-Meier存活曲线。箭头指示来自KG4:T124注射组的单只动物的处死日。P＝0.0058，对数秩检验。图4呈现了来自人恶性胶质瘤裸鼠模型的EGFR再靶向miR-124敏感性HSV载体治疗的实验结果的数据。颅内移植磨碎的GBM30细胞并在5天后在相同坐标注射PBS或1.8x108gc的KGE或KGE-4:T124病毒。(A)Kaplan-Meier存活曲线。对数秩统计：KGE对PBS，P＝0.0188；KGE-4:T124对PBS，P＝0.0009；KGE对KGE-4:T124，P＝0.8327。(B)肿瘤细胞移植后的经时动物重量。X，动物死亡或安乐死。图5呈现的数据证明KMMP9介导酶活性MMP9的过表达。(A)KMMP9和KGw的结构。(B)感染KMMP9、KGw或KG(MOI＝0.1)的Vero细胞的细胞裂解物的蛋白印迹分析。β-微管蛋白和HSV糖蛋白B分别可视化作细胞和病毒加载对照。采用KGw或KMMP9在MOI＝1下感染原代GBM细胞系(C)或Vero细胞(D)。感染24小时后收集细胞裂解物和上清液并组合(C)或单独加载(D)在10％聚丙烯酰胺/0.1％明胶凝胶上。电泳后37℃下过夜培养所述凝胶，用0.05％考马斯蓝染色并脱染，并记录图像。缩写：M，KMMP9；G，KGw；KG，对照病毒；un.，未感染；gB，糖蛋白B；Sup.，上清液。图6呈现的数据证明KMMP9和KGw显示出可比的细胞进入和生长模式。(A)在图上列出的多种gc/细胞下采用病毒感染图左所列细胞。6小时后固定细胞并免疫染色ICP4。(B)分离GBM30和(C)GBM169细胞并采用KMMP9或KGw在200gc/细胞下进行感染。在1、2、4和6dpi下收集细胞裂解物并通过qPCR测定病毒基因组拷贝滴度。在任一宿主细胞系中均未观测到两种病毒间的显著性差异(GBM30：P＝0.20；GBM169：P＝0.11)。图7呈现的数据证明KMMP9在与KGw的比较中显示出相似或更高的体外肿瘤细胞杀灭。10或100gc/细胞下感染U87、SNB19或GBM30细胞3或7天。通过MTT试验测定相对于未感染细胞的细胞存活百分数(n＝3；星号：P<0.05，未配对学生t检验)。图8呈现的数据证明MMP9改善oHSV在球状体中的感染性。在悬浮液中生长GBM30细胞并用1x103pfu的KMMP9或KGw对其进行感染。2-6dpi下在整体球状体中每日可视化两种载体中来自gC-T2a-eGFP盒的绿色荧光。(A)3和5dpi下的代表性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其包含：(a)呈现在所述oHSV衣壳表面上的非HSV配体，其对癌细胞表面上存在的分子具有特异性；和(b)插入HSV在正常(非癌性)细胞中复制所需的HSV基因的基因座中的多个拷贝的一种或多种microRNA靶序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.28 US 61/896,4971.一种重组溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)，其包含：(a)呈现在所述oHSV衣壳表面上的非HSV配体，其对癌细胞表面上存在的分子具有特异性；和(b)插入HSV在正常(非癌性)细胞中复制所需的HSV基因的基因座中的多个拷贝的一种或多种microRNA靶序列。2.权利要求1所述oHSV，其中所述配体并入暴露在所述HSV表面上的糖蛋白中。3.权利要求1或2所述oHSV，其中所述病毒包膜蛋白是gD或gC。4.权利要求1-3任一项所述oHSV，其中所述配体并入gD的残基1和25之间。5.权利要求1-4任一项所述oHSV，其中所述配体能够特异性结合EGFR或EGFRvIII。6.权利要求1-5任一项所述oHSV，其中所述配体是结合细胞受体的单链抗体(scFv)或者肽或非肽激素或者生长因子。7.权利要求1-6任一项所述oHSV，其中所述microRNA靶序列是microRNA的反向互补序列。8.权利要求1-7任一项所述oHSV，其包含插入所述HSV基因的基因座中的两个或多个(串联的2个、3个、4个、5个或6个)所述microRNA靶序列。9.权利要求8所述oHSV，其包含插入所述HSV基因的基因座中的4个串联拷贝的所述microRNA靶序列。10.权利要求8或9所述oHSV，其中所述多拷贝的所述microRNA靶序列通过所述oHSV基因组内的四个或更多个核苷酸的间隔序列相分离。11.权利要求1-10任一项所述oHSV，其中插入所述microRNA靶序列的所述HSV基因是ICP4。12.权利要求1-11任一项所述oHSV，其中所述microRNA靶序列插入所述HSV基因的3’非翻译区(3’UTR)。13.权利要求1-12任一项所述oHSV，其中所述microRNA是miR-124。14.权利要求1-12任一项所述oHSV，其中所述microRNA是miR-122、miR-124、miR-128、miR-137和/或miR-199，或其两种或多种的组合。15.一种重组oHSV，其包含(a)针对癌细胞表面上存在的蛋白具有特异性的非HSV配体，其为特异性结合EGFR或EGFRvIII的scFv，且其插入所述oHSV gD糖蛋白的残基1和25之间，和(b)插入所述oHSV基因组的ICP4的3’UTR中的4个拷贝的microRNA ...
【专利技术属性】
技术研发人员：内田宏昭，J·科恩，J·C·格洛廖索三世，P·格兰迪，
申请(专利权)人：联邦高等教育系统匹兹堡大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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