巨细胞病毒检测并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。本发明专利技术公开了一种巨细胞病毒检测并联探针，包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3；还公开了含有上述探针的基因芯片以及该基因芯片的试剂盒；还公开了利用该试剂盒进行巨细胞病毒检测的方法：使用本发明专利技术巨细胞病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染巨细胞病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。本发明专利技术操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，结果准确可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种巨细胞病毒检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
技术介绍
巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)亦称细胞包涵体病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，故名。它是一种疱疹病毒组DNA病毒。分布广泛，其他动物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。CMV在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺其他腺体，以及多核白细胞和淋巴细胞，可长期或间隙地自唾液、乳汗血液、尿液、精液、子宫分泌物多处排出病毒。通常口腔，生殖道，胎盘，输血或器官移植等多途径传播。妊娠母体CMV感染可通过胎盘侵袭胎儿引起先天性感染，少数造成早产、流产、死产或生后死亡。患儿可发生黄疸，肝脾肿大，血小板减少性紫斑及溶血性贫血。存活儿童常遗留永久必性智力低下，神经肌肉运动障碍，耳聋和脉络视网膜炎等。目前检测巨细胞病毒的方法比较常用的方法是ELISA法，普遍存在敏感性低、特异性差、存在假阳性的缺点。巨细胞病毒的感染影响着人口素质，与优生优育有重要关系。生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类，可以分为基因芯片和蛋白质芯片等两大类。相较于蛋白质芯片，基因芯片利用的是核苷酸链之间的互补作用，特异性强，重现性好。基因芯片指的是将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的巨细胞病毒检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。本专利技术实现其目的的技术方案为：一种巨细胞病毒检测并联探针，包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3。一种巨细胞病毒检测基因芯片，包括固体相和权利要求1所述的探针组。作为优选地，所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。一种巨细胞病毒检测试剂盒，包括前述的基因芯片。在上述巨细胞病毒检测试剂盒中，还包括巨细胞病毒靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.4、5所示。作为优选地，所述引物对的下游引物的5’端含有生物素标记。作为优选地，上述巨细胞病毒检测试剂盒，还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和素、洗涤液、TMB显色液。在上述技术方案中，10μL的PCR反应体系包括：50～150ng/μL的扩增模板0.4μL，Premix Taq 5μL，浓度为8～12μM的上、下游引物各0.2μL。一种巨细胞病毒检测方法，使用前述的巨细胞病毒检测试剂盒进行检测，当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染巨细胞病毒；当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。作为优选地，PCR扩增反应程序为95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。本专利技术的有益效果是：设计三条高特异性的探针，当3条探针均检测出阳性时才判断该项指标为阳性，能极大的提高产品的准确性和精确性，减少其它方法容易出现的假阳性问题；本专利技术通过PCR技术对病原体基因组进行扩增，检测的特异性高，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过生物素标记，显色液进行显色后，可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读，直观的表现检测结果，检测操作简单、结果易读，满足医院、产前检测等的现场检测需求，为优生优育及诊断巨细胞病毒感染提供可靠的实验依据。附图说明图1为检测巨细胞病毒的基因芯片的示意图。图2为待测样品巨细胞病毒基因扩增后PCR产物电泳条带图；Y-C：巨细胞病毒；M:10000bp marker。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。主要试剂及生产者：氨基修饰的玻璃基片(武汉阳达生物科技有限公司)，病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒(货号DP438，天根生化科技(北京)有限公司)，亲和素(辣根过氧化物酶标记)(碧云天生物技术研究所)，TMB显色液(上海生工生物工程有限公司)，Premix Taq(TAKARA公司，日本):成分为PrimeSTARHS DNA Polymerase,dNTP Mixture,PrimeSTARBuffer。引物合成公司为英潍捷基(上海)贸易有限公司。实施例1目的片段引物与探针设计查找NCBI数据库中巨细胞病毒的基因序列，选择高特异性的基因序列作为靶序列(ID号为：FJ491284.1)，设计引物与探针。靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计巨细胞病毒靶基因的扩增引物与探针，为了使芯片结果用显色液显色后可直接通过肉眼判读，在巨细胞病毒靶基因扩增引物的R引物5’端用生物素进行标记，具体序列如下：巨细胞病毒(CMV)靶序列扩增引物：F引物(CMV-F)：5’-AGGTGACACCAGAGAATCAG-3’(SEQ ID NO.4)，R引物(CMV-R)：5’-biotin-CTTCATTACACTGATAACCT-3’(SEQ ID NO.5)。CMV并联探针：CMV探针1：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTTGAGGCTACAATAGCCTC-3’(SEQ ID NO.1)，CMV探针2：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAGGTCATCCACACGCGTAG-3’(SEQ ID NO.2)，CMV探针3：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAAAGACCTTCATGCGAC-3’(SEQ ID NO.3)。实施例2芯片的制备将实施例1中CMV的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修饰的玻璃基片上，得到含有探针的基因芯片(如图1所示)。探针浓度为30μM，每个点0.2μL，然后80℃孵育1.5小时。表1 巨细胞病毒检测芯片探针排列顺序实施例3检测方法1、待测样品基因组提取使用病毒基因组DNA/RNA共提试剂盒，按照操作说明书的步骤提取待测样品的基因组作为扩增模板。2、PCR扩增目的片段经过大量实验摸索，确定CMV检测的靶基因PCR扩增体系和PCR反应程序。总体积为10μL的PCR扩增体系含有如下试剂：名称加入量Premix Taq5μLF引物(10μM)0.2μLR引物(10μM)0.2μL扩增模板0.4μL双蒸水4.2μLPCR反应程序为：95℃5min；95℃10s、55℃30s、72℃30s、30个循环；72℃10min。3、PCR产物与芯片杂交按照如下步骤操作：a.在实施例2中制备好的基因芯片上，将待测样品的PCR扩增产物点样到3个探针的检测孔中，具体步骤为：PCR产物95℃解链5分钟，迅速置于冰上，PCR产物与杂交缓冲液(50％甲酰胺，10×SSC，0.2％SDS)等体积混合，每孔点10微升混本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巨细胞病毒检测并联探针，其特征在于：包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3。
【技术特征摘要】
1.一种巨细胞病毒检测并联探针，其特征在于：包括探针1、2、3，序列分别为SEQ ID NO.1～3。2.一种巨细胞病毒检测基因芯片，其特征在于：包括固体相和权利要求1所述的探针组。3.如权利要求2所述的巨细胞病毒检测基因芯片，其特征在于：所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或者硝酸纤维素膜。4.一种巨细胞病毒检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求2或3所述的基因芯片。5.如权利要求4所述的巨细胞病毒检测试剂盒，其特征在于：还包括巨细胞病毒靶基因扩增引物对，引物对序列如SEQ ID NO.4、5所示。6.如权利要求5所述的巨细胞病毒检测试剂盒，其特征在于：所述引物对的下游引物的5’端含有生物素标记。7.如权利要求6所述的巨细胞病毒检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、亲和素、...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，徐建，
申请(专利权)人：重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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