本发明专利技术公开了一种小麦质膜上的Na+/H+逆转运蛋白基因及其应用。该Na+/H+逆转运蛋白基因全长3460bp，该基因表达后定位在细胞质膜上，发挥Na+/H+交换功能，将Na+排到胞外，因而还本发明专利技术还公开了利用所述Na+/H+逆转运蛋白基因构建植物遗传转化载体，以及提高植物耐盐性的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传工程领域，具体涉及一种能将Na+排到胞外的Na+/H+逆转运蛋白基因及其应用。
技术介绍
2000年首次从拟南芥中克隆了SOS1基因并被认为是位于质膜上的Na+/H+ 逆转运蛋白，在其N端是12个串膜结构域，在C端有长的亲水尾巴。亚细胞定位的结果表明该蛋白定位在细胞膜上，是目前植物中仅有的被鉴定位于质膜上的负责Na+外流的蛋白。Na+/H+逆转运蛋白将H+转运到胞内的同时将Na+运送到胞外。拟南芥中该基因的突变使得植物体对盐非常敏感，且造成Na+外排和Na+从根部到茎叶长距离运输的缺陷。通常情况下SOS1会通过C端的自我抑制结构域和临近的结构域相互作用使SOS1处于休眠状态，SOS2-SOS3激酶复合体将SOS1磷酸化从而激活SOS1，SOS1蛋白C端的[V,I]VR[V,I]DSPS 基序中的两个丝氨酸是发生磷酸化的位点。如果磷酸化位点或被SOS2-SOS3复合体识别的位点发生突变都会抑制SOS1的活性。在水稻中克隆了Na+/H+ 逆转运蛋白，与拟南芥中的SOS1基因同源，位于质膜上具有Na+/H+转运的功能，转化酵母后降低酵母中的Na+含量，拟南芥中的SOS2-SOS3复合体可以激活水稻OsSOS1。OsSOS1转化拟南芥sos1突变体后可以降低突变体对盐的敏感性。以上结果表明SOS信号通路在谷类作物中存在并发挥作用，这说明SOS通路在单子叶和双子叶植物中存在保守性。木本植物白杨中研究结果表明SOS信号通路的相关蛋白可以和拟南芥中的蛋白一一对应，并互补拟南芥相应突变体的表型。拟南芥、水稻和杨树中的实验充分证明了SOS通路在草本、木本植物中，单子叶和双子叶植物中都存在，并且功能是保守的。小麦中SOS1基因的研究也取得了一些成果，最近用非损伤微测技术检测小麦根Na+离子流时，在耐盐品种Kharchia 65检测到较强的Na+离子外流现象，证明该现象由质膜H+-ATPase提供能量，由SOS1同源基因介导产生。本专利技术对小麦TaSOS1基因进行克隆和功能研究，发现可以互补盐敏感酵母突变体；转化拟南芥sos1突变体后可以降低突变体对盐的敏感性，过表达则提高转基因拟南芥的耐盐性；小麦中SOS1基因的沉默也会导致小麦叶片Na+离子含量的提高。
技术实现思路
本专利技术人通过比对拟南芥和水稻的SOS1基因序列，设计引物，在小麦品种科遗26中克隆了小麦的SOS1基因，Genebank登录号为FN356229，并和拟南芥、水稻的SOS1基因进行比对，发现和水稻、拟南芥中的SOS1蛋白也表现出序列高度相似性。经遗传转化拟南芥和酵母的结果分析发现，小麦SOS1基因可以提高拟南芥和酵母的耐盐性，小麦中SOS1基因的沉默也会导致小麦叶片Na+离子含量的提高。本专利技术的目的是提供一种质膜Na+/H+逆转运蛋白基因，该基因能将植物体内的Na+离子排到胞外。本专利技术所提供的基因来源于耐盐小麦品种科遗26，是具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列，或其简并序列组成。SEQ ID No.1所示的DNA长度为3460 bp（其中ORF区为3429）, 是细胞核基因，位于小麦第三同源群A染色体上，命名为TaSOS1-A1，编码1143个氨基酸残基的蛋白质。本专利技术提供扩增上述基因全长的引物对，所述引物对中，正向引物的序列为SEQ ID No.2所示，反向引物的序列为SEQ ID No.3所示。本专利技术提供包含所述基因的表达载体，所述基因可操作连接于35S启动子。将所述的表达载体转化到植物中，并筛出耐盐性的植株。本专利技术提供的小麦Na+/H+逆转运蛋白基因利用基因工程技术将其遗传转化到双子叶植物拟南芥中，过表达可以提高拟南芥的耐盐性，同时可以互补拟南芥sos1突变体。本专利技术提供包含所述基因的酵母表达载体，所述基因可操作连接于表达载体的启动子下游。本专利技术提供的小麦Na+/H+逆转运蛋白基因利用基因工程技术将其遗传转化到缺乏内源Na+转运体系的酵母中，并筛出可以互补缺乏内源Na+转运体系的酵母株系。本专利技术提供包含所述基因的病毒载体，所述基因可操作连接于病毒载体的T7启动子和复制原点下游。本专利技术提供的小麦Na+/H+逆转运蛋白基因利用基因工程技术将其遗传转化到单子叶禾本科植物小麦中，降低小麦内源基因TaSOS1-A1的表达，增加小麦叶片Na+的积累。因此，利用TaSOS1-A1能创制耐盐性材料，这为小麦的耐盐性研究提供了有价值的材料，对小麦的遗传改良具有重要意义。附图说明图1为TaSOS1-A1基因的染色体定位。图2为双子叶植物双元表达载体的构建流程。图3为拟南芥转基因植株的PCR和RT-PCR鉴定结果，其中，A为PCR鉴定结果，从左至右上样顺序为：野生型阴性对照、野生型转基因株系T1-6、T1-9和T1-10、突变体阴性对照、突变体转基因株系T1-1、T1-2和T1-7；B为转野生型RT-PCR鉴定结果，从左至右上样顺序为：阴性对照、野生型转基因株系T1-6、T1-9和T1-10；C为转突变体RT-PCR鉴定结果，从左至右上样顺序为：突变体阴性对照、突变体转基因株系T1-1、T1-2和T1-7。图4为转基因拟南芥在MS和MS加NaCl培养基上生长实验结果，sos1为突变体， T1-1、T1-2和T1-7分别为转突变体的转基因株系，col 为野生型，T1-6、T1-9和T1-10分别为转野生型的转基因株系。图5为转基因酵母株系阳性克隆PCR鉴定，AXT3-A和ANT3-A分别代表TaSOS-A1单独转化AXT3和ANT3突变体，CK为转化空载体对照。图6为转基因酵母在AP和AP加NaCl培养基上生长实验结果，W303为野生型， AXT3和ANT3分别代表转空载体的突变体，AXT3-A和ANT3-A分别代表TaSOS-A1单独转化AXT3和ANT3突变体。野生型、突变体和转基因酵母在AP培养基上的生长，10倍梯度稀释滴在AP或AP+30 mM NaCl的培养基上，28℃培养3天后拍照。图7为转基因酵母细胞Na+、K+ 浓度和K+ /Na+比。图8为病毒诱导PDS基因沉默表型，A为不含BSMV病毒缓冲液侵染小麦叶片的接种对照；B为PDS基因片段的BSMV病毒侵染小麦叶片表型。图9为病毒诱导TaSOS1-A1基因沉默定量PCR表达分析。图10为病毒诱导TaSOS1-A1基因沉默的植株叶片的Na+、K+ 浓度。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1 小麦质膜Na+/H+逆转运蛋白基因TaSOS1-A1的获得1. 小麦质膜Na+/H+逆转运蛋白基因TaSOS1-A1的分离，具体包括如下步骤：（1）将小麦科遗26（Tritium aestivum L.）的种子用10%的花王水溶液对种子进行表面消毒10分钟，用灭菌蒸馏水洗涤3遍。将种子放入有两层消毒滤纸的培养皿中，在室温中放置2天后（90%种子萌发）将培养皿放入4℃冰箱中处理24 h，使萌发的种子均一化。然后将培养皿放在培养室（23℃，16 h光照/8 h黑暗）中生长2天，将生长一致的幼苗置入含1/2 Hogland营养液的容器中进行水培，大约7天后取幼苗叶片洗净本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物Na+/H+ 逆转运蛋白基因，其特征在于：所述基因是SEQ ID No.1所示核苷酸序列，或其简并序列组成。
【技术特征摘要】
1.一种植物Na+/H+ 逆转运蛋白基因，其特征在于：所述基因是SEQ ID No.1所示核苷酸序列，或其简并序列组成。2.包含权利要求1所述基因的表达载体。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其是酵母表达载体。4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其是病毒载体载体。5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于：将权利要求1所述基因可操作连接于启动子和转录原点。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：将权利要求1所述基因可操作连接于35S启动子。7.根据权利要求1所述的基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：高振贤，张爱民，史占良，阳文龙，刘冬成，郭进考，
申请(专利权)人：石家庄市农林科学研究院，
类型：发明
国别省市：河北;13
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