细胞培养基制造技术

本发明专利技术大体上涉及一种培养基，例如血清替代物、培养基补充物、完全培养基或低温保存培养基，所述培养基包含基础生理缓冲剂和包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体。预期与不使用本文中所描述的血清替代物培养的细胞相比，培养基提供改良的培养中细胞生长的优点。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2013年12月20日提交的美国临时专利申请第61/918,833号的优先权，所述临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。
本专利技术大体上涉及一种细胞培养基组合物，例如血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其包含热力学稳定脂质体和液体基础混合物以在无血清环境中培养细胞。预期脂质体包含胆固醇和卵磷脂以及脂肪酸。也预期包含脂质体的低温保存培养基，其用于在冷冻期间保存细胞。
技术介绍
用于体外实验或离体培养以投予人类或动物的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)培养为人类疾病研究和治疗的一种重要工具。细胞培养广泛用于生产各种生物活性产品，如病毒疫苗、单克隆抗体、多肽生长因子、激素、酶以及肿瘤特异性抗原。然而，用于培养细胞的许多培养基或方法包含可能对细胞生长和/或未分化细胞培养物的维持具有负面影响的组分。举例来说，哺乳动物或昆虫细胞培养基常常补充有来自血液的血清，如小牛血清(fetal calf serum；FCS)或胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)，以便提供促进细胞在培养物中增殖和生长的生长因子、载体蛋白、附着和扩散因子、养分以及微量元素。然而，在FCS或FBS中发现的因子(如转型生长因子(transforming growth factor；TGF)β或网膜酸)可促进特定细胞类型分化(Ke等人,《美国病理学杂志(Am J Pathol.)》137:833-43,1990)或引发细胞中可促进培养物中非所需细胞活性的不希望的下游信号传导(Veldhoen等人,《自然免疫学(Nat Immunol.)》7(11)：1151-6,2006)。血清组合物的非典型性和血清的批间差异使得无血清培养基中血清替代物和培养物的使用为理想的(Pei等人,《男科学集刊(Arch Androl.)》49(5):331-42,2003)。另外，由于在向人体投予时潜在的病毒污染和/或动物蛋白的潜在免疫原性效应，因此对于在细胞培养物中生长的用于治疗用途的细胞、重组蛋白或疫苗来说，添加来源于动物的组分为不希望的。已经研发血清替代物以尝试最小化FCS对细胞培养的影响，以及最小化用于人类细胞培养的动物蛋白的量。如KNOCKOUTTM血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA)的血清替代物称为化学成分确定的培养基，其缺乏血清且含有用于细胞生长的基本养分和其它蛋白质。由于缺乏附着因子，使得此调配物中细胞附着不充分，因此KNOCKOUT SRTM无法用作饲养细胞平板培养中的FBS的替代物。PC-1TM无血清培养基(Lonza,Walkersville,MD)为在特殊改性DMEM/F12培养基基础中调配的低蛋白无血清培养基且含有具有已知量的胰岛素、转铁蛋白、脂肪酸以及专有蛋白质的完全HEPES缓冲系统。Cellgro COMPLETETM(Cellgro,Manassas,VA)为基于DMEM/F12、RPMI 1640以及麦克柯伊氏(McCoy's)5A基础培养基混合物的无血清低蛋白培养基。Cellgro COMPLETETM不含胰岛素、转铁蛋白、胆固醇、生长或附着因子，但包含微量元素和高分子量碳水化合物、附加维生素、非动物蛋白源以及牛血清白蛋白的混合物。无血清培养基也描述于国际专利公开案第WO2009023194号、国际专利公开案第WO2008137641号、国际专利公开案第WO2006017370号、国际专利公开案第WO2001011011号、国际专利公开案第WO2007071389号、国际专利公开案第WO2007016366号、国际专利公开案第WO2006045064号、国际专利公开案第WO2003064598号、国际专利公开案第WO2001011011号；美国专利公开案第US20050037492号、美国专利公开案第US20080113433号、美国专利公开案第US20080299540号；美国专利第4,560,655号、美国专利第5,324,666号、美国专利第6,162,643号、美国专利第6,103,529号、美国专利第6,048,728号、美国专利第7,709,229号以及欧洲专利申请第EP2243827号中。美国专利7,220,538描述一种包含亲脂性纳米粒子和基础营养培养基的细胞培养基。
技术实现思路
本专利技术提供一种包含基础生理缓冲剂液体混合物和包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体的培养基，其可用作血清替代物、完全培养基或培养基补充物。所述培养基适用于促进初生细胞或细胞系在细胞培养物中存活、生长和增殖，其中所述培养基包含具有有助于细胞维持和生长的脂质形态的脂质体。也预期包含脂质体的低温保存培养基。在各种实施例中，本专利技术提供一种用于悬浮液或贴壁培养物中的细胞的培养基，所述培养基包含：基础生理缓冲剂液体混合物；和(a)包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升；或(b)果胶；或(a)和(b)。在各种实施例中，脂质体包含脂质、脂肪酸、固醇和/或游离脂肪酸。示例性脂肪酸包括(但不限于)次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸、油酸肉豆蔻油酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、反油酸、异油酸、反亚油酸、α-次亚麻油酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、芥子酸、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸以及蜡酸。在各种实施例中，脂质体包含一或多种由次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸以及油酸所构成的群组中选出的脂肪酸。在各种实施例中，脂质体进一步包含乙醇胺和聚山梨醇酯。在各种实施例中，脂质体包含抗氧化剂。在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含有机盐、无机盐、缓冲剂、铁源或铁转运体、甘油、氨基酸、维生素、糖以及微量元素中的一或多者。任选地，基础生理缓冲剂液体混合物包含抗氧化剂。在各种实施例中，铁源或铁转运体是由以下各者所构成的群组中选出：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、盐酸L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。在各种实施例中，基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的有机盐或无机盐：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡、硫酸锌以及碳酸氢钠。在各种实施例中，脂质体或基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种抗氧化剂。示例性抗氧化剂包括(但不限于)生育酚、生育三烯酚、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、α-生育本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于悬浮或贴壁培养中细胞的培养基，所述培养基包含基础生理缓冲剂液体混合物和(a)包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升；或(b)果胶；或(a)和(b)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 US 61/9188331.一种用于悬浮或贴壁培养中细胞的培养基，所述培养基包含基础生理缓冲剂液体混合物和(a)包含胆固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂质体，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升；或(b)果胶；或(a)和(b)。2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述脂质体包含一或多种由次亚麻油酸、亚麻油酸、肉豆蔻酸以及油酸所组成的群组中选出的脂肪酸。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其中所述脂质体进一步包含乙醇胺和聚山梨醇酯。4.根据权利要求1到3中任一项所述的培养基，其中果胶在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为25毫克/升到500毫克/升。5.根据权利要求1到4中任一项所述的培养基，其中所述基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种有机盐、无机盐、缓冲剂、铁源或铁转运体、甘油、氨基酸、维生素、糖、抗氧化剂以及微量元素。6.根据权利要求5所述的培养基，其中甘油在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为2微升/升到0.5毫升/升。7.根据权利要求5所述的培养基，其中所述铁源或铁转运体是由以下各者所构成的群组中选出：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、柠檬酸铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、苹果酸铁铵以及丁二酸铁铵。8.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、盐酸L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸以及L-缬氨酸。9.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的盐：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化锡、硫酸锌以及碳酸氢钠。10.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的维生素：生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟碱酰胺、盐酸吡哆醇、双黄素(biboflavin)、盐酸硫胺、维生素B12以及异肌醇。11.根据权利要求5所述的培养基，其中所述培养基包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的微量元素：硒、钼酸盐、铬、钴、镍、锌、铜、锰、钡、镓、锂、锡、钛、溴、碘、钒、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锆、镉以及铝。12.根据权利要求11所述的培养基，其中所述微量元素为硒，且硒在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为0.005毫克/升到0.05毫克/升。13.根据前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述培养基为血清替代物、完全培养基、培养基补充物或低温保存培养基。14.一种血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其包含脂质体和基础生理缓冲剂液体混合物，其中所述脂质体包含卵磷脂、乙醇胺、次亚麻油酸、亚麻油酸、胆固醇以及聚山梨醇酯，且所述基础液体混合物包含至少一种无机盐、至少一种糖、甘油以及至少一种微量元素。15.根据权利要求14所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，进一步包含至少一种非离子表面活性剂和至少一种铁源。16.根据权利要求14所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述脂质体的量使得胆固醇在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在细胞悬浮液或贴壁培养物中的最终浓度为100毫克/升到1000毫克/升。17.根据权利要求14到16中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述基础生理缓冲剂液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的盐：磷酸钾、氯化钙(无水)、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁(无水)、硫酸镁(无水)、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸锌以及氯化锡。18.根据权利要求14到17中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含氯化钠、氯化钾、磷酸钠以及磷酸钾。19.根据权利要求14到18中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的微量元素：硒、钼酸盐、铬、钴、镍、锌、铜、锰、钡、镓、锂、锡以及钛。20.根据权利要求19所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含硒和钼酸盐。21.根据权利要求13到19中任一项所述的血清替代物、完全培养基或培养基补充物，其中所述液体混合物包含一或多种由以下各者所构成的群组中选出的铁源或铁转运体：转铁蛋白、乳铁蛋白、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁、硝酸铁、硫酸铁、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵、草酸铁铵、反丁烯二酸铁铵、...

【专利技术属性】
技术研发人员：A埃尔霍菲，A韦伯，
申请(专利权)人：基本药品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US