本发明专利技术属于环境资源利用领域，具体涉及一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法。分别将产朊假丝酵母和白地霉进行活化、扩增培养，得到两种液体菌种；将黄酒糟和米浆水灭菌后，加入一定量的氮源，充分混合、灭菌后作为液态发酵培养基；将两种液体菌种按一定比例接入液态发酵培养基并充分混匀，接入空气曝气泵，以1 vvm曝气率，自然pH，30℃条件下发酵4~6天，固液分离后取固体进行真空冷冻干燥，即可得到发酵单细胞蛋白产品。该发酵产品中粗蛋白含量高，可达66%，营养成分全面，粗蛋白、氨基酸和粗脂肪等成分均高于国家标准对饲料成分的要求，并且制备方法可实现连续化生产，经济可行，具有广阔的市场前景和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境资源利用领域，具体涉及一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法。
技术介绍
黄酒是具有我国民族特色的酿造酒，因其低度和保健两大健康优势，正逐渐跨出国门，成为国际市场上具有竞争优势的酒精食品。我国约有700多家黄酒加工企业，黄酒年平均产量达130万吨。而随着黄酒加工技术与设备的不断发展，黄酒加工废弃物的处理问题也越来越严峻，污染防治逐步从单一的对排放污染物无害化的末端处理防治，开始转变为对整个生产周期防污减排、降低成本和后期污染物资源化处理的清洁生产综合治理方式。同时国家发展战略也对可持续发展，提高资源利用率提出了更高的要求，因此对黄酒加工废弃物的资源化处理将会成为食品加工工业可持续发展的必经之路。目前国内对黄酒加工废弃物同时稳定化和资源化处理技术鲜有报道，在生产应用上则更屈指可数。基于此，对黄酒加工废弃物高值化、无害化处理技术的研究具有较高的理论与实际应用价值。在黄酒生产工艺中的浸米和压榨两道工序中会分别产生黄酒加工废弃物米浆水和黄酒糟，1吨黄酒会产出0.65吨米浆水和200~300斤的黄酒糟。米浆水是在黄酒酿造过程的浸米工序中产生的废弃物，富含蛋白质和氨基酸，具有很高的营养价值，同时是一类高浓度有机废水，如果直接排放会带来严重的环境问题。原料中的淀粉会在淀粉酶作用下转化成糖类，而空气中的乳酸菌等微生物则会利用这部分营养物质生长繁殖，同时合成乳酸，因此米浆水呈酸性，且含有高浓度有机物。目前国内对米浆水处理的报道相对较少，一些研究者主要利用微生物菌群生物吸附和混凝澄清技术去除米浆水中的有机物。黄酒糟主要为大米等原料经过糖化发酵之后的残渣，主要成分为淀粉、粗蛋白、脂类和丰富的氨基酸，具有较高的营养价值。因此，将黄酒糟作为动物饲料是目前最廉价且普遍的处理方式。综合利用方面，黄酒糟在制备调味食品、酒曲、回收氨基酸和合成蛋白质领域均取得了良好的研究进展。但是，虽然黄酒糟和米浆水各自有其处理的方式，目前的报道中尚未出现将两者混合一起处理的先例。同作为黄酒加工的废弃物，若能将二者共同处理，将能提高处理效率，改善处理效果，进一步实现资源化利用的需求。菌体蛋白饲料的生物合成大多采用单一菌种或组合菌种混合发酵，从目前的研究和应用来看，混合发酵的效果要优于单菌种发酵的效果。混合发酵利用了微生物种间协作、协同互生的特性，多个菌种之间可互相补偿其缺陷，共同生长，对发酵基质进行完全的分解利用。以酒糟等原料作为基质发酵产蛋白的方法很多，但大部分都是以固态发酵为主。固态发酵确实具有操作简单、成本低的优势，但是自动化程度较低，不适用于大批量生产。本专利技术采用的液态发酵可以实现连续发酵，自动化程度高，并有利于单细胞蛋白的分离和提取。同时，液态发酵可结合黄酒加工过程中产生的米浆水，在一次发酵过程中实现对两种废弃物的处理。且在实验结果中表明，液态发酵产品中的粗蛋白含量更高，发酵效果更好。优化真菌发酵的方式有很多种，其中适当的曝气率是研究的关键因素，曝气程度会影响碳和氮的利用率。然而目前国内的专利报道中有提及需维持一定氧气含量的，但并未有专门研究曝气率的相关报道。因此本专利技术在液态发酵中接入曝气装置，研究不同曝气率对真菌发酵产蛋白的影响。探讨最佳的曝气率，实现真菌生长的最适条件。同时在中试装置中，曝气方式可通过气提式反应器实现，简便低耗地实现液态发酵的曝气。目前国内外仅有以黄酒糟为基质通过酶法提取或培养家蝇蝇蛆利用其蛋白质的专利报道，尚未有使用混菌发酵生产单细胞蛋白的专利报道。如专利200510050063.9报道了以黄酒糟为基质提取蛋白质的方法，利用碱性蛋白酶进行酶解反应提纯蛋白质；专利201010193736.7亦报道了以黄酒糟为基质提取蛋白质的方法，利用纤维素酶、碱性酶和淀粉酶对黄酒糟进行蛋白水解，进而进行膜分离；专利201210027903.X报道了黄酒糟转化动物蛋白的方法，采用黄酒糟培养家蝇蝇蛆，获得高蛋白含量的家蝇蝇蛆产品。这些专利均只是对黄酒糟内的蛋白质进行提取利用，并没有提高所得产品的蛋白含量，存在蛋白含量低、营养价值低、营养成分单一等问题。而单细胞蛋白则是微生物自身合成的具有较高营养价值的蛋白质资源，含量丰富、营养价值高。另外，在有关单细胞蛋白合成的专利报道中，已有利用各类基质进行发酵的先例，其中以酒糟为基质的专利有201410337144.6（白酒糟）、201410115988.6（木薯酒糟）、201010114112.1（白酒糟）、95108669.3（啤酒糟）、201510239887.4（白酒糟）、201510302675.6（玉米酒糟）、201410174205.1（白酒糟）、201510394909.4（白酒糟）、200810044216.2（白酒糟），这些报道中粗蛋白的含量基本在30%~40%之间，增长率最高可达26%，粗蛋白的含量及增长率不算高，发酵效果仍有较大改善空间。除了以酒糟为基质外，也有专利是以银杏叶提取物、豆渣、制浆废液、醋糟为基质进行真菌发酵产蛋白的，在这类报道中，粗蛋白产量最佳的是专利201310427156.3（银杏叶渣），粗蛋白含量达到58~65%。针对以上专利技术的不足，本专利技术提出以黄酒糟与米浆水为原料采用混菌液态发酵的方法生产单细胞蛋白。该方法采用组合菌种发酵，所制备得到的干物质中的蛋白含量高，粗蛋白含量在不同发酵条件下均能达到45%左右，最高可达66.3%，增长率可达29.7%，同时含有必要的氨基酸以及粗脂肪，相对于发酵前的黄酒糟初始蛋白含量（36.6%）有较大提高，能良好地实现黄酒糟与米浆水的综合利用。本专利技术能利用黄酒加工过程中产生的黄酒糟以及米浆水作为资源，通过发酵制备高价值的单细胞蛋白产品，充分遵循了物质循环利用的定律，为黄酒加工废弃物高值化、无害化处理技术提供支撑，满足绿色可循环发展的道路。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种以黄酒加工废弃物为原料进行混菌发酵生产单细胞蛋白的方法，该方法操作简单、易于控制、生产成本低、工艺产量大，且制备得到的发酵产品粗蛋白含量高，并含有8种常见氨基酸，具有作为动物饲料的潜力。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法，以黄酒加工过程中产生的黄酒糟和米浆水为原料，采用产朊假丝酵母和白地霉对黄酒糟米浆水混合物进行混菌液态发酵，包括以下步骤：（１）菌种培养：a. 菌株活化将产朊假丝酵母和白地霉菌株分别放置于安瓿瓶内，在超净台下用酒精灯下加热顶端灭菌，用镊子敲下，用1 mL无菌针筒吸取0.4 mL YPD液体培养基，加入安瓿瓶中，摇晃至产朊假丝酵母和白地霉菌株悬浮，移至50 mL比色管中，加入30 mL 经121℃高压灭菌20 min后的YPD液体培养基（蛋白胨5 g，酵母提取物2.5 g，葡萄糖5 g，溶解定容至500 mL）中，盖上纱布和锡纸，放置28℃生化培养箱中培养3天后加入5 mL丙三醇，保存于-24℃冷藏室；b. 菌株种子液制备微波炉高火4 min解冻YPD固体培养基（YPD培养基25 g，溶解定容至500 mL），倒置灭菌的培养皿，等待冷却后，将无菌接种环蘸取一环活化菌液，在培养皿中三段划线，28℃培养3天；分别从扩大培养后的固体培养基中挑取少量菌种于液体培养基中，28本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，以黄酒加工过程中产生的黄酒糟和米浆水为原料，采用产朊假丝酵母和白地霉对黄酒糟米浆水混合物进行混菌液态发酵，包括以下步骤：（１）菌种培养：a. 菌株活化将产朊假丝酵母和白地霉菌株分别放置于安瓿瓶内，在超净台下用酒精灯下加热顶端灭菌，用镊子敲下，用1 mL无菌针筒吸取0.4 mL YPD液体培养基，加入安瓿瓶中，摇晃至产朊假丝酵母和白地霉菌株悬浮，移至50 mL比色管中，加入30 mL 经121℃高压灭菌20 min后的YPD液体培养基（蛋白胨5 g，酵母提取物2.5 g，葡萄糖5 g，溶解定容至500 mL）中，盖上纱布和锡纸，放置28℃生化培养箱中培养3天后加入5 mL丙三醇，保存于‑24℃冷藏室；b. 菌株种子液制备微波炉高火4 min解冻YPD固体培养基（YPD培养基25 g，溶解定容至500 mL），倒置灭菌的培养皿，等待冷却后，将无菌接种环蘸取一环活化菌液，在培养皿中三段划线，28℃培养3天；分别从扩大培养后的固体培养基中挑取少量菌种于液体培养基中，28℃生化培养箱，180 rpm振荡培养10 h后，每隔2 h取少量菌液4层无菌纱布过滤，除去菌丝，用血球计数板对滤液孢子数计数，当每毫升孢子数数量级达107时，菌液可以作为液体种子液使用；（2）制备液态发酵培养基将黄酒糟和米浆水按6~25%质量百分浓度配比后，充分混合均匀，并加入氮源，在121℃下高压灭菌20 min，冷却后得到黄酒糟米浆水液态发酵培养基；（3）混菌液态发酵制备单细胞蛋白将步骤（１）所得的达到107数量级的产朊假丝酵母和白地霉种子液按1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、1:3、和3:1（菌液体积比）的接种至经121℃高压灭菌20 min后的300 mL酒糟米浆水液态发酵培养基中，产朊假丝酵母和白地霉种子液的接种总量为液体发酵培养基重量的5%‑50%，接种完毕后充分混匀，接入空气曝气泵，以0.5~2 vvm曝气率，自然pH，30℃条件下发酵4~6天，固液分离后取固体进行真空冷冻干燥，即可得到发酵单细胞蛋白。...
【技术特征摘要】
1.一种混菌液态发酵黄酒加工废弃物生产单细胞蛋白的方法，其特征在于，以黄酒加工过程中产生的黄酒糟和米浆水为原料，采用产朊假丝酵母和白地霉对黄酒糟米浆水混合物进行混菌液态发酵，包括以下步骤：（１）菌种培养：a. 菌株活化将产朊假丝酵母和白地霉菌株分别放置于安瓿瓶内，在超净台下用酒精灯下加热顶端灭菌，用镊子敲下，用1 mL无菌针筒吸取0.4 mL YPD液体培养基，加入安瓿瓶中，摇晃至产朊假丝酵母和白地霉菌株悬浮，移至50 mL比色管中，加入30 mL 经121℃高压灭菌20 min后的YPD液体培养基（蛋白胨5 g，酵母提取物2.5 g，葡萄糖5 g，溶解定容至500 mL）中，盖上纱布和锡纸，放置28℃生化培养箱中培养3天后加入5 mL丙三醇，保存于-24℃冷藏室；b. 菌株种子液制备微波炉高火4 min解冻YPD固体培养基（YPD培养基25 g，溶解定容至500 mL），倒置灭菌的培养皿，等待冷却后，将无菌接种环蘸取一环活化菌液，在培养皿中三段划线，28℃培养3天；分别从扩大培养后的固体培养基中挑取少量菌种于液体培养基中，28℃生化培养箱，180 rpm振荡培养10 h后，每隔2 h取少量菌液4层无菌纱布过滤，除去菌丝，用血球计数板对滤液孢子数计数，当每毫升孢子数数量级达107时，菌液可以作为液体种子液使用；（2）制备液态发酵培养基将黄酒糟和米浆水按6~25%质量百分浓度配比后，充分混合均匀，并加入氮源，在121℃下高压灭菌20 min，冷却后得到黄酒糟米浆水液态发酵培养基；（3）混菌液态发酵制备单细胞蛋白将步骤（１）所得的达到107数量级的产朊假丝酵母和白地霉种子液按1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、1:3、和3:1（菌液体积比）的接种至经121℃高压灭菌20 min后...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢丽，何秋颖，陈渊源，庞维海，周琪，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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