本发明专利技术公开了检测马铃薯S病毒的成套试剂及其在利用数字PCR检测马铃薯S病毒中的应用。本发明专利技术公开的检测马铃薯S病毒的成套试剂，由名称为X1的引物对和名称为PVS‑p的探针组成；X1由PVS‑f和PVS‑r组成；PVS‑f是序列表中序列1所示的单链DNA；PVS‑r是序列表中序列2所示的单链DNA；PVS‑p的序列为序列表中序列3，PVS‑p的5'端由FAM标记，3'端由TAMRA标记。实验证明，本发明专利技术的检测马铃薯S病毒的成套试剂可用于特异性数字PCR，并且特异性好、灵敏度高(灵敏度可达15拷贝/μL)，适用于潜隐病症和病毒含量低的样品中PVS的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中检测马铃薯S病毒的成套试剂及其在利用数字PCR检测马铃薯S病毒中的应用。
技术介绍
马铃薯S病毒病(potato virus S,PVS)是马铃薯的主要病毒病之一，我国马铃薯种植区普遍发生，且危害较严重。PVS单独侵染一般不表现症状，但可导致马铃薯减产10％-20％，与其他病毒混合侵染，可减产20％-30％。PVS易通过汁液传播，接触传染是自然传播的主要途径，也可通过蚜虫进行非持久性传播。感染PVS病毒的马铃薯植株常产生小块茎，并通过块茎无性繁殖进行世代积累和传递，致使块茎种性变劣，产量不断下降。由于马铃薯S病毒病症潜隐难以辨认，同时在种薯脱毒过程中脱毒率通常较低。为保证种薯质量，要求在脱毒种薯生产中要有严格的检测。目前，针对PVS主要采用指示植物和酶联免疫法(ELISA)等方法进行检测，ELISA虽然可以在短时间内检测大量样品，但该方法存在标准阳性对照较难获得，相对费用低的抗血清种类不全，检测灵敏度低及整个实验操作流程较复杂等因素的限制。RT-PCR技术相对于血清检测法不用制备抗体，而且省时又省力，已经用于PVS的检测，但对病毒浓度低的样品(如韧皮部样品和休眠未出芽或自然老的块茎)却不足以做出可靠的诊断。数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松分布(Poisson distribution)公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测马铃薯S病毒。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了检测马铃薯S病毒的成套试剂。本专利技术所提供的检测马铃薯S病毒的成套试剂，由名称为X1的引物对和名称为PVS-p的探针组成；所述X1由PVS-f和PVS-r组成；所述PVS-f是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：a1)序列表中序列1所示的单链DNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述PVS-r是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：b1)序列表中序列2所示的单链DNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述PVS-p的序列为如下c1)至c4)中的任一种序列：c1)序列表中序列3的序列；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；c3)与c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列。上述成套试剂中，a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列1所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列2所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列3所示的序列的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的序列1、序列2或序列3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述成套试剂中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。上述成套试剂中，所述PVS-p的两端可被荧光染料标记。具体可为：所述PVS-p的5'端由FAM标记，和/或，所述PVS-p的3'端由TAMRA标记。上述成套试剂中，所述PVS-f、所述PVS-r和所述PVS-p均可独立包装。所述PVS-f和所述PVS-r的摩尔比可为1:1。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测马铃薯S病毒的引物对。本专利技术所提供的检测马铃薯S病毒的引物对，为所述X1。所述X1的两条单链DNA可独立包装。其中，所述PVS-f、所述PVS-r和所述PVS-p的摩尔比可为2:2:1。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测马铃薯S病毒的系统。本专利技术所提供的检测马铃薯S病毒的系统，包括所述成套试剂或所述引物对。上述系统，还可包括进行RNA逆转录和/或数字PCR检测马铃薯S病毒所需的试剂和仪器。具体来说，检测马铃薯S病毒的系统可包括所述成套试剂以及进行RNA逆转录和/或数字PCR所需要的其它试剂和仪器。所述系统具体可由所述成套试剂和M1组成，所述M1为M1a和/或M1b，所述M1a为进行RNA逆转录所需的试剂和/或仪器，所述M1b进行数字PCR所需的试剂和/或仪器。所述成套试剂中的各单链DNA以及进行RNA逆转录所需要的其它试剂、进行数字PCR所需要的其它试剂均可独立包装。进行RNA逆转录所需要的其它试剂可为Takara公司的逆转录试剂盒中试剂。进行数字PCR所需要的其它试剂可为数字PCR扩增SuperMix、数字PCR微滴生成卡和微滴生成用油。数字PCR扩增SuperMix、数字PCR微滴生成卡和微滴生成用油均可为Bio-Rad产品。进行数字PCR所需要的仪器可为数字PCR反应系统，如Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio-Rad QX200)。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述任一方法：1)所述成套试剂的制备方法，包括将所述成套试剂中各单链DNA独立包装；2)所述引物对的制备方法，包括将所述引物对中两条单链DNA独立包装；3)所述系统的制备方法，包括将所述成套试剂中各单链DNA独立包装。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测马铃薯S病毒的方法。本专利技术所提供的检测马铃薯S病毒的方法，包括A1)或A2)：A1)利用所述成套试剂对待测样品进行数字PCR，根据反应结果中扩增微滴的有无确定所述待测样品是否为马铃薯S病毒或是否含有马铃薯S病毒：如有扩增微滴，所述待测样品为或候选为马铃薯S病毒或所述待测样品含有或候选含有马铃薯S病毒；如无扩增微滴，所述待测样品不为或候选不为马铃薯S病毒或所述待测样品不含有或候选不含有马铃薯S病毒；A2)利用所述X1中对待测样品进行PCR扩增，根据扩增产物的有无确定所述待测样品本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测马铃薯S病毒的成套试剂，由名称为X1的引物对和名称为PVS‑p的探针组成；所述X1由PVS‑f和PVS‑r组成；所述PVS‑f是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：a1)序列表中序列1所示的单链DNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述PVS‑r是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：b1)序列表中序列2所示的单链DNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述PVS‑p的序列为如下c1)至c4)中的任一种序列：c1)序列表中序列3的序列；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；c3)与c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列。
【技术特征摘要】
1.检测马铃薯S病毒的成套试剂，由名称为X1的引物对和名称为PVS-p的探针组成；所述X1由PVS-f和PVS-r组成；所述PVS-f是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：a1)序列表中序列1所示的单链DNA；a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述PVS-r是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：b1)序列表中序列2所示的单链DNA；b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；所述PVS-p的序列为如下c1)至c4)中的任一种序列：c1)序列表中序列3的序列；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列；c3)与c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列。2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述PVS-p的两端被荧光染料标记。3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述PVS-p的5'端由FAM标记，和/或，所述PVS-p的3'端由TAMRA标记。4.检测马铃薯S病毒的引物对，为权利要求1中所述X1。5.检测马铃薯S病毒的系统，包括权利要求1-3中任一所述成套试剂或权利要求4所述引物对。6.根据权利要求5所述的系...
【专利技术属性】
技术研发人员：张永江，黄洁芳，朱鹏宇，付伟，王晨光，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国吴江出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：北京;11
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