本发明专利技术公开了一种同时分析烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，包括以下步骤：A、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的提取；B、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化；C、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化产物色谱分析。D、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的定量分析。本发明专利技术建立的一种微波辅助提取‑乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯衍生‑超高效液相色谱‑紫外检测器同时测定烟草中的铵离子、25种氨基酸与8种生物胺的方法，具有简单、快速、高灵敏度且稳定性好等优点，可以提高样品检测通量与数据准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种简单、稳定、准确的同时分析烟草中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，属于烟草化学成分的测定方法
技术介绍
铵离子是植物能够直接利用的氮源，是合成烟草重要含氮化合物-蛋白质、氨基酸、生物碱、核苷酸等的重要原料之一，尽管硝态氮也能被植物直接吸收，但不能够直接利用。硝态氮进入植物体后，必须经过硝酸还原酶与亚硝酸还原酶转化为铵离子后才能进入代谢合成途径，从而被植物利用并真正发挥营养元素的作用。氨基酸是一类带有氨基(-NH2)或亚氨基(-NH)的有机酸的总称，是细胞的重要组成部分，在植物生命活动中担负着各种生理作用。氨基酸主要通过以下方式对植物产生影响，如水分生理中的作用、光呼吸氮代谢中的作用、花粉生理中的作用、衰老中的作用、细胞生长的作用与解毒作用等。此外，氨基酸的含量与烟草的品质也有着密切的关系，其含量的高低直接影响到烟的味道和烟气的丰满度，在烟叶的烘烤、陈化、调制及抽吸过程中均会与烟叶中的还原糖发生梅拉德反应而形成多种重要的致香成分，故烟叶中氨基酸种类的多少和含量的高低会直接影响烟叶的内在品质。生物胺是一类含氮的低分子量有机化合物的总称。根据其组成成分可以分为单胺与多胺。生物胺在烟草生长发育过程中发挥着不可替代的作用。例如一些生物胺通过生物学作用可以生成激素、核酸和蛋白质的前提物。多胺可以刺激生长，延缓衰老的作用，在植物逆境抵抗体系的构建中起重要的推动作用。此外，多胺也是合成烟碱的重要前体物之一，多胺中的腐胺经过腐胺N-甲基转移酶形成N-甲基腐胺，进一步由腐胺N-甲基氧化酶氧化得到N-甲基氨基丁醛，N-甲基氨基丁醛自发转变为合成烟碱所必须的吡咯烷环，从而与烟酸反应形成烟碱。铵离子进入根部细胞质后可很快地与代谢过程产生的有机酸结合形成氨基酸与酰胺，并且释放质子以补偿电荷。如果植物中存在过量的铵离子，植物就会产生铵中毒，氨基酸中的谷氨酰胺与天冬酰胺可以通过GS和GOGAT酶合成对应的谷氨酰胺与天冬酰胺，从而缓解植物的铵中毒反应。生物胺都是通过对应氨基酸的脱羧基化后形成，例如合成烟碱的重要前提物多胺（腐胺）有二条合成途径，一条为精氨酸脱羧酶， 另一条为鸟氨酸途径，其关键酶分别为精氨酸脱羧酶与是鸟氨酸脱羧酶。因此，铵离子、氨基酸及生物胺之间有这密切的联系，具体表现为铵离子为初始阶段，氨基酸为中间阶段，最后阶段为生物胺。因此，对这三类物质进行同时定性与定量尤为重要。由于氨基酸与生物胺类物质极性强，挥发性差，且未有紫外吸收的生色团等特性，采用直接检测法存在峰形不对称、灵敏度低，选择性不强等缺陷，而铵离子是无机离子，常常需要离子色谱才能进行分析，但离子色谱无法同时对氨基酸与多胺进行分析。因此，目前对这三类物质的检测主要为柱前衍生化方法，衍生方法主要有气相衍生与液相衍生。其中气相衍生化主要为硅烷化与乙酰化反应，这2种反应都需要在严格无水的条件下进行，且衍生化产物稳定性也较差。此外，氨基酸硅烷化的重复性较差，相对标准偏差在20%左右。液相衍生化主要是将生色团引入到未有紫外吸收的物质结构中，从而使其有紫外吸收或发出荧光。主要的液相衍生试剂有邻苯二甲醛、茚三酮、氯甲酸-9-芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯与异硫氰酸苯酯等，但这些衍生试剂都存在衍生反应慢，衍生产物稳定性差，且价格较昂贵等缺陷。综上所述，在烟草化学成分的测定
中，目前还没有一套简单、快速、高灵敏度且稳定性好的关于烟叶中铵离子、氨基酸及多胺类物质的同时检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种能够同时分析烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，该方法具有简单、快速、高灵敏度且稳定性好等优点，可以提高样品检测通量与数据准确性；另外，三类物质的同时分析，也大大降低了分析工作量，可以有效的克服现有技术的不足。本专利技术的技术方案是：一种同时分析烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，包括以下步骤：A、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的提取：称取烤烟粉末或鲜烟叶于离心管中，然后加入两种内标溶液，再加入1.8 mL提取溶液进行微波辅助提取，离心后，上层清液过水系滤膜得滤液；B、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化：取步骤A中滤液1 mL于离心管中，加入8.5 μL 3 M氢氧化钠溶液，涡旋后加入1 mL缓冲溶液、0.3 mL有机溶剂与30 μL衍生化试剂，涡旋混匀后进行超声衍生化，反应后加入60 μL 3 M的氢氧化钠溶液，混匀后放入水浴中除去过量的衍生化试剂，反应后冷却，过有机滤膜后于色谱瓶中；C、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化产物色谱分析：采用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器进行色谱分析；D、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的定量分析：对有标准品的化合物进行绝对定量，对未有标准品的化合物进行相对定量。所述步骤A中微波辅助提取的条件为微波能量800 W、提取时间40 s。所述步骤A中两种内标为1 mg/mL的氨基己二酸和1 mg/mL的正缬氨酸。所述步骤A中提取溶液为0.1%的甲酸水溶液。所述步骤B中缓冲溶液是pH为9.0-9.2的0.8 M硼酸缓冲液。所述步骤B中有机溶剂为甲醇或已腈。所述步骤B中衍生化试剂为乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯。所述步骤B中水浴条件为80℃水浴50 min。所述步骤C中超高效液相色谱使用的流动相为25 mM乙酸铵与已腈，利用梯度洗脱方式进行分离。本专利技术的有益效果是：本专利技术建立了一种微波辅助提取-乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯衍生-超高效液相色谱-紫外检测器同时测定烟草中的铵离子、25种氨基酸与8种生物胺的方法。本专利技术为了获得最大的提取效率，对微波辅助提取采用了析因设计和Doehlert设计进行方法优化，与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）微波辅助提取大大减少了提取时间，从40-60 min减少到40 s；2）乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯衍生化试剂价格便宜，可以同时衍生化氨基与亚氨基，反应简单且副产物较少，衍生化产物检测灵敏度高且稳定；3）能同时分析三类物质（铵离子、25种氨基酸与8种生物胺），大大降低了分析工作量；4）具有简单、快速、高灵敏度且稳定性好的特点，可以有效提高样品检测通量与数据准确性。附图说明图 1烟叶中铵离子、25种氨基酸及8种生物胺的检测方法流程图；图2 烟叶中铵离子、23种氨基酸及5种生物胺的标准品衍生化产物UPLC-PDA色谱图（280 nm）；图3 烟叶中铵离子、25种氨基酸及8种生物胺的烟叶样品衍生化产物UPLC-PDA色谱图（280 nm）。具体实施方式实施例1：参考图1，本专利技术检测方法包括以下步骤：（1）称取烤烟粉末100 mg或鲜烟叶50 mg（冻干样品）于离心管中，然后加入40 μL内标（氨基己二酸-1 mg/mL；正缬氨酸-1 mg/mL），再加入1.8 mL 0.1%的甲酸水溶液进行微波（800 W）辅助提取40 s，3000 rpm离心5 min后，上层清液过0.45 μm水系滤膜；（2）取1 mL上层滤液于离心管中，加入8.5 μL 3 M氢氧化钠溶液，涡旋后加入1 mL 0.8 M硼酸缓冲液（pH=9.0-9.2），再加入0.3 mL甲醇或已腈及30 uL的乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯，涡旋1 min后常温超声35 min反本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时分析烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的提取：称取烤烟粉末或鲜烟叶于离心管中，然后加入两种内标溶液，再加入1.8 mL提取溶液进行微波辅助提取，离心后，上层清液过水系滤膜得滤液；B、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化：取步骤A中滤液1 mL于离心管中，加入8.5 μL 3 M氢氧化钠溶液，涡旋后加入1 mL缓冲溶液、0.3 mL有机溶剂与30 μL衍生化试剂，涡旋混匀后进行超声衍生化，反应后加入60 μL 3 M的氢氧化钠溶液，混匀后放入水浴中除去过量的衍生化试剂，反应后冷却，过有机滤膜后于色谱瓶中；C、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化产物色谱分析：采用超高效液相色谱‑光电二极管阵列检测器进行色谱分析；D、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的定量分析：对有标准品的化合物进行绝对定量，对未有标准品的化合物进行相对定量。
【技术特征摘要】
1.一种同时分析烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的提取：称取烤烟粉末或鲜烟叶于离心管中，然后加入两种内标溶液，再加入1.8 mL提取溶液进行微波辅助提取，离心后，上层清液过水系滤膜得滤液；B、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化：取步骤A中滤液1 mL于离心管中，加入8.5 μL 3 M氢氧化钠溶液，涡旋后加入1 mL缓冲溶液、0.3 mL有机溶剂与30 μL衍生化试剂，涡旋混匀后进行超声衍生化，反应后加入60 μL 3 M的氢氧化钠溶液，混匀后放入水浴中除去过量的衍生化试剂，反应后冷却，过有机滤膜后于色谱瓶中；C、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的衍生化产物色谱分析：采用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器进行色谱分析；D、烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的定量分析：对有标准品的化合物进行绝对定量，对未有标准品的化合物进行相对定量。2.根据权利要求1所述的同时分析烟叶中铵离子、氨基酸及生物胺的色谱检测方法，其特征在于：所述步骤A中微波辅助提取的条件为微波能量800 W、提取时间40 s。3.根据权利要求1所述的同时分...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡凯，赵会纳，向章敏，蔡斌，雷波，潘文杰，高维常，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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