方法技术

由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体转导分离的细胞群以获得该治疗性细胞群。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及造血干细胞（HSC）和造血祖细胞。更具体地，本专利技术涉及用于HSC的基因修饰的改进方法。本专利技术还涉及用于基因修饰的造血干细胞和祖细胞在基因疗法中的用途的改进方法。专利技术背景造血系统是不同的成熟细胞谱系的细胞的复杂层次结构。这些包括提供对病原体的防护的免疫系统的细胞、携带氧通过身体的细胞以及涉及伤口愈合的细胞。所有这些成熟细胞来自于能够自我更新并分化成任何血细胞谱系的造血干细胞（HSC）的池。由于HSC能够补充整个造血系统，它们可用于移植，例如在血液毒性损伤如放疗或化疗之后，或用于更换白血病细胞。造血细胞移植（HCT）是对数种遗传性和获得性疾病的治愈性疗法。但是，同种异体HCT受限于匹配供体的低可获得性，以及与同种异体程序相关的死亡率，其大多涉及移植物抗宿主疾病（GvHD）和深远且持久的免疫功能紊乱状态所引发的感染性并发症。基于移植基因改造的自体HSC的基因治疗途径提供了超出同种异体HCT的潜在改善的安全性和有效性。它们对缺少匹配的供体的患者尤其重要。干细胞基因疗法的概念基于较少数量的干细胞的基因修饰。这些在体内通过进行自我更新而长期存留，并生成大量基因“修正的”后代。这确保了在患者的余生持续供应修正的细胞。HSC对基因疗法是特别有吸引力的目标，因为在它们分化时，它们的基因修饰将传递至所有血细胞谱系。此外，HSC可以容易和安全地获自例如骨髓、动员的外周血和脐带血。HSC及其后代的有效的长期基因修饰需要能够将校正DNA稳定整合到基因组中而不影响HSC功能的技术。长期的益处需要移植足够高数量的修饰的HSC，其可以重新填充经调整的骨髓，产生所有造血谱系的修正的血细胞。自体HSC因此令移植程序可用于所有患者，避免导致GvHD的免疫相容性问题，并允许最低限度的免疫抑制调节疗法，由此大大减少感染性并发症。基于慢病毒的HSC基因疗法试验已经证实了它们在治疗遗传疾病方面的治疗潜力。但是，用于HSC的基因修饰的方法仍困难重重。现有的HSC基因疗法方案（例如Cartier N等人, Science 2009;326:818-823；Cavazzana-Calvo M等人, Nature 2010;467:318-322；Biffi A等人, Science 2013;341:1233158；Aiuti A等人, Science. 2013;341:1233151）在HSC基因修饰过程中使用2-4天的体外培养。更长的培养时间通常产生更高的转导水平。但是，体外培养不利地影响HSC功能，并且这种负面影响明显与培养的持续时间相关联（Guenechea G等人, Blood 1999;93:1097-1105；Xu R等人, Transfusion 2001;41:213-218；Mazurier F等人, Blood 2004;103:545-552；Ahmed等人, Blood 2004;103:2079-2087；Glimm H等人, Exp. Hematol. 2005;33:20-25；Kallinikou K等人, Br. J. Haematol. 2012;158:778-787）。尽管对改善HSC的体外扩增已经取得了一些进展（Zhang CC等人, Blood 2008;111:3415-3423；Boitano AE等人, Science 2010;329:1345-1348；Delaney C等人, Nat. Med. 2010;16:232-236；Himburg HA等人, Nat. Med. 2010;16:475-482；Csaszar E等人, Cell Stem Cell 2012;10:218-229；Walasek MA等人, Ann. N. Y. Acad. Sci. 2012;1266:138-150），所得方案对临床转化存在一些挑战，给出变数并常常给出再现性不佳的结果，并仍需要在相关的临床情况下得到证实。因此，在HSC基因疗法背景下的体外培养应保持尽可能短。因此，需要设计能够获得造血干细胞的有效基因修饰同时最大程度缩短培养时间的改进方案。此外，该改进方案必须适于临床应用。
技术实现思路
我们已经预料不到地显示，当CD34+CD38- HSC以高纯度呈现时经历更有效的转导。我们已经开发了以适于临床应用的方式纯化和转导这些细胞的方案。我们还发现，前列腺素E2及其衍生物提高了基因转移到CD34+和CD34+CD38- HSC中的效率。这些预料不到的发现导致了提高的转导效率，这能够减少施加的载体量并最大程度减少体外培养。由这些发现继续，我们已经开发了基于转导的、高度纯化的长期再植细胞（例如表达CD34而不表达CD38的细胞）与未经处理的祖细胞（例如表达CD38的细胞）的共同移植的创新方案。该方案可以通过以下手段改善基因疗法的安全性和有效性：1．提高转导效率；2．减少转导所需的细胞数量，这导致了较低的灌注到受试者中所需的整合负荷；3．确保了快速造血恢复。此外，我们还开发了基于转导的造血祖细胞的移植的创新方案。根据本专利技术的第一方面，提供了由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体，优选用病毒载体转导分离的细胞群以获得治疗性细胞群。在本专利技术的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：a．从包含造血干细胞的起始细胞群分离表达CD38的细胞；b．从不表达CD38的步骤（a）中获得的细胞群中分离表达CD34的细胞；c．用载体转导步骤（b）中获得的表达CD34的细胞群以获得治疗性细胞群。在另一实施方案中，该方法包括以下步骤：a．使包含造血干细胞的起始细胞群与CD38反应性试剂接触；b．使CD38反应性细胞与CD38非反应性细胞分离；c．使步骤（b）中获得的CD38非反应性细胞与CD34反应性试剂接触；d．使CD34反应性细胞与CD34非反应性细胞分离，其中该CD34反应性细胞构成转导细胞群；e．用载体转导所述转导细胞群以获得治疗性细胞群。该治疗性细胞群可能具有CD34+CD38-表型。在一个实施方案中，该载体包含相关核苷酸，或本身为相关核苷酸。在一个实施方案中，分离的表达CD38的细胞或CD38反应性细胞或其一部分被保留以形成支持细胞群。该支持细胞群可以具有CD34+CD38int1、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型。在本专利技术的一个实施方案中，用载体转导细胞群的步骤包括培养该细胞大约44小时或更久。“用载体转导细胞群的步骤”理解为预刺激和载体暴露阶段。例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约44-66小时、44-60小时、44-54小时或44-48小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约66、60、54、48或44小时。在本专利技术的另一实施方案中，用载体转导细胞群的步骤包括培养该细胞（即在预刺激和载体接触过程中）小于大约44小时。例如，在用载体转导的步骤过程中，细胞群可以培养大约12-42小时、12-36小时、12-24小时或12-18小时。在一个实施方案中，在用载体转导的步骤过程中，细胞群培养大约42、36、30、24、18或12小时。本文档来自技高网...

【技术保护点】
由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体转导所述分离的细胞群以获得该治疗性细胞群。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.24 GB 1318830.5;2014.05.21 GB 1409067.41.由包含造血干细胞的起始细胞群制备用于临床应用的治疗性细胞群的方法，所述方法包括从起始细胞群中分离基本不表达CD38但表达CD34的细胞群，并用载体转导所述分离的细胞群以获得该治疗性细胞群。2.权利要求1的方法，其中该方法包括以下步骤：a.从包含造血干细胞的起始细胞群中分离表达CD38的细胞；b.从不表达CD38的步骤（a）中获得的细胞群中分离表达CD34的细胞；c.用载体转导步骤（b）中获得的表达CD34的细胞群以获得治疗性细胞群。3.权利要求1的方法，其中该方法包括以下步骤：a.使包含造血干细胞的起始细胞群与CD38反应性试剂接触；b.将CD38反应性细胞与CD38非反应性细胞分离；c.使步骤（b）中获得的CD38非反应性细胞与CD34反应性试剂接触；d.将CD34反应性细胞与CD34非反应性细胞分离，其中所述CD34反应性细胞构成所述转导细胞群；e.用载体转导所述转导细胞群以获得所述治疗性细胞群。4.前述权利要求任一项的方法，其中所述治疗性细胞群具有CD34+CD38-表型。5.前述权利要求任一项的方法，其中包含造血干细胞的起始细胞群获自动员的外周血、骨髓或脐带血。6.权利要求3-5中任一项的方法，其中CD38或CD34反应性试剂分别是抗CD38或抗CD34抗体。7.权利要求6的方法，其中所述抗CD38和/或抗CD34抗体结合到磁珠或可检测标记物上。8.权利要求2或4-7中任一项的方法，其中表达CD38的细胞和/或表达CD34的细胞使用基于磁珠的分离或流式细胞术来分离。9.权利要求3-7中任一项的方法，其中CD38反应性细胞和/或CD34反应性细胞使用基于磁珠的分离或流式细胞术来分离。10.前述权利要求任一项的方法，其中所述载体是病毒载体。11.权利要求10的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体。12.权利要求10的方法，其中所述病毒载体包含相关核苷酸。13.前述权利要求任一项的方法，其中所述用载体转导细胞群的步骤包括培养所述细胞小于大约44小时。14.权利要求2、4-8或10-13中任一项的方法，其中保留所述分离的表达CD38的细胞或其一部分以构成支持细胞群。15.权利要求3-7或9-13中任一项的方法，其中保留所述分离的CD38反应性细胞或其一部分以构成支持细胞群。16.权利要求14或15中任一项的方法，其中所述支持细胞群具有CD34+CD38int1、CD34+CD38int2和/或CD34+CD38+表型。17.按照前述权利要求任一项的方法制备的治疗性细胞群。18.按照权利要求14-16中任一项的方法制备的支持细胞群。19.包含权利要求17的治疗性细胞群的药物组合物。20.包含权利要求18的支持细胞群的药物组合物。21.用于药物的权利要求17的治疗性细胞群。22.用于药物的权利要求17的治疗性细胞群，其中所述治疗性细胞群与权利要求18的所述支持细胞群组合施用。23.用于药物的权利要求18的支持细胞群...

【专利技术属性】
技术研发人员：L纳尔迪尼，BR根特纳，E佐纳里，F博卡拉特，
申请(专利权)人：圣拉法埃莱医院有限公司，泰莱托恩基金会，
类型：发明
国别省市：意大利;IT