一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，包括：将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中获得荚膜多糖溶液，所述荚膜多糖溶液与CDAP接触活化获得活化后溶液，将所述活化后溶液与载体蛋白接触结合获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。本发明专利技术所提供的方法对CDAP法进行改进，采用硼酸盐缓冲液溶解肺炎链球菌荚膜多糖，不需要在反应中调节pH值，化学试剂使用减少，制备工艺简单，生产效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药化学领域，具体涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法。
技术介绍
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)为革兰氏阳性细菌，可导致相当高的发病率和死亡率，引起肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等疾病。现已发现近百种肺炎链球菌血清型，而只有其中20几种有致病性。肺炎链球菌荚膜多糖为其主要毒力决定因素，因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体影响，而且其本身具弱免疫原性。2000年2月肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗Prevnar首先在美国得到许可，随后国际市场上陆续出现了10价、11价、13价肺炎链球菌多糖蛋白结合疫苗。肺炎链球菌结合疫苗在儿童中普遍接种，疫苗所包含的血清型致侵入性肺炎链球菌疾病显著减少。制备结合物所常用的活化多糖方法大致有：溴化氰(CNBr)活化法，CDAP活化法，水溶性碳化二亚胺(EDC)法。CDAP活化法是先在多糖羟基上形成氰酸酯，通过异脲键将多糖与载体蛋白质连接起来。有资料表明，CDAP法能快速有效地活化肺炎链球菌多糖。CDAP活化多糖的关键参数是浓度和pH值，传统的CDAP法，是采用酸碱试剂调节维持反应中的pH值完成多糖的活化反应，用己二胺、己二酰肼为间隔基，在一定pH值下与载体蛋白质结合，并以酸碱试剂维持结合反应中的pH值，反应过程中需要对反应的pH和温度进行连续监控，操作步骤多，效率低、反应可控制性差。
技术实现思路
本专利技术的目的是简化肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物制备的过程，提供一种简便高效的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法。为达到以上目的，本专利技术提供了一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，包括：将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中获得荚膜多糖溶液。进一步的，所述方法还包括，将荚膜多糖溶液与CDAP接触活化获得活化后溶液，将所述活化后溶液与载体蛋白接触结合获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。具体的，本专利技术对于将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液的方式没有特别的限制，只要能够形成充分溶解、性状均一的溶液即可。例如可以在室温下，搅拌溶解。其中，所述荚膜多糖溶液与CDAP接触活化的步骤包括：在15-25℃下将CDAP按比例加入荚膜多糖溶液中，活化2-4min。在本专利技术的一种实施方式中，可以将CDAP溶于乙腈或注射用水中，形成CDAP浓度为100-200mg/mL的储备液。在活化步骤结束后，室温条件下按比例加入载体蛋白，搅拌反应2-4h，获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。在本专利技术的一种实施方式中，在接触结合步骤后，可以将体系经氯化钠溶液透析、Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，收集kD值0-0.3的分离峰得到纯化后的产物。优选的，所述硼酸盐缓冲液中硼酸的浓度为0.2-0.3mol/L，pH值为8.5-9.5。特别优选的，所述硼酸盐缓冲液中硼酸根的浓度为0.25mol/L，pH值为9.0-9.2。可选的，所述硼酸盐缓冲液的制备方法包括将硼酸和盐溶于水后用酸碱碱调节pH值。其中，所述盐可以为氯化钾或氯化钠，在所述硼酸盐缓冲液中，硼酸根离子的浓度与氯离子或钠离子的浓度的比例可以为0.8-1.2：1。在本专利技术的一种实施方式中，所述硼酸盐缓冲液是按照以下方式配制的：硼酸盐缓冲液浓度为0.25mol/L，称取15.458g硼酸和18.638g氯化钾，加入注射用水950mL，用5mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.0-9.2，补加注射用水至1000mL即可。优选的，所述荚膜多糖溶液中荚膜多糖的浓度为6-32mg/mL。可选的，所述荚膜多糖为水解后kD值为0.2-0.65的荚膜多糖，血清型包括但不限于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F型。可选的，当所述荚膜多糖的血清型为1、2、3、8、12F、15B、17F、18C、23F或33F型时，荚膜多糖溶液中荚膜多糖的浓度为6-20mg/mL。可选的，当所述荚膜多糖的血清型为4、5、6A、6B、7F、9N、9V、10A、11A、14、19A、19F、20或22F型时，荚膜多糖溶液中荚膜多糖的浓度为15-32mg/mL。需要理解的是，以上所述的荚膜多糖浓度均为单一血清型的荚膜多糖浓度，并非为多种血清型荚膜多糖的总浓度。在本专利技术中，上述列举的荚膜多糖的血清型的名称均为按照本领域技术人员所公知的标准进行分类所确定的本领域所公知的血清型，并可以通过多种途径(例如购买、赠与等方式)获得。本专利技术对于产生各种血清型的菌株没有特别的限制，可以为本领域所有目前已知或未知的生产特定血清型荚膜多糖的肺炎链球菌菌株。可选的，当荚膜多糖的血清型为3、4、8、9N、9V、11A、14、18C、19F、23F或33F型时，荚膜多糖与CDAP的质量比为1：0.1-0.3。可选的，当荚膜多糖的血清型为1、2、5、6A、6B、7F、10A、12F、15B、17F、19A、20或22F型时，荚膜多糖与CDAP的质量比为1:0.2-0.6。其中，载体蛋白为破伤风类毒素TT和/或白喉类毒素DT。其中，相对于所述荚膜多糖，载体蛋白的用量可以按照以下比例确定，多糖：蛋白质量比为1：1-2.5。利用本专利技术所提供的方法制备获得的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物也属于本专利技术的保护范围。具体的，在本专利技术的一种实施方式中，每种荚膜多糖溶液中只含有一种血清型的荚膜多糖，荚膜多糖溶液与载体蛋白结合后获得单价的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。当需要制备含有多个肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的多价疫苗时，可以利用本领域技术人员所公知的方法将单价的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物按一定比例进行混合。特别值得注意的是，在本专利技术所提供的方法中，不需要对所述荚膜多糖溶液的pH值进行调节后再进行接触活化，接触活化的过程中也不再对体系的pH值进行调整，在接触活化后，不需要对所述活化后溶液进行pH值的调节，也不使用间隔基(例如己二胺、己二酰肼)，直接将所述活化后溶液与载体蛋白进行接触结合，接触结合过程中不需要对体系的温度和pH值进行监测和调整，结合2-4h后进行柱纯化即可以完成肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备。与现有技术相比极大的提高了制备的效率，缩短了生产时间，减少了生产人员和试剂的投入。本专利技术所提供的方法，通过将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中使得反应体系获得了合适的理化环境，这种合适的理化环境允许在后续制备过程中不需要再对体系的pH、温度进行监测和调节，不需要添加额外的试剂以保证制备过程顺利进行；这种合适的理化环境使得后续的活化和结合步骤能够在稳定的条件下进行，避免了活化和结合步骤因为部分组分的变化所引起的体系理化环境的变化，极大了简化了肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备过程。采用本专利技术制备的结合物原液，其游离多糖含量均小于30％，所得结合物，具有肺炎链球菌多糖的抗原性和免疫原性。本专利技术所述的制备方法或利用本专利技术所提供的方法制备的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物可应用于制备单价或多价肺炎链球菌结合疫苗(例如13价疫苗)。所述单价或多价肺炎链球菌结合疫苗中可包含基于铝的佐剂。例如，所述铝佐剂可以为氢氧化铝、磷酸铝或明矾。具体实施方式下面结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于包括：将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中获得荚膜多糖溶液。

【技术特征摘要】
1.一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，其特征在于包括：将肺炎链球菌荚膜多糖溶解于硼酸盐缓冲液中获得荚膜多糖溶液。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硼酸盐缓冲液中硼酸根的浓度为0.2-0.3mol/L，pH值为8.5-9.5。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述荚膜多糖溶液与CDAP接触活化获得活化后溶液，将所述活化后溶液与载体蛋白接触结合获得肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述荚膜多糖为水解后kD值为0.2-0.65的荚膜多糖，血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F型。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荚膜多糖的血清型为1、2、3、8、12F、15B、17F、18C、23F或33F型，荚...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明华，庞强，唐秀丽，任涛，段霄，何迎枫，崔晓雪，刘建凯，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11