用于基因组编辑的CRISPR-CAS系统和组合物的递送、用途和治疗应用技术方案

本发明专利技术提供了用于操纵靶序列的序列和/或活性的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化。提供了递送系统和被靶向作为用于递送的部位的组织或器官。还提供了载体和载体系统以及用于设计和使用此类载体的方法，其中这些载体和载体系统中的一些编码CRISPR复合物的一种或多种组分。还提供了指导在真核细胞中形成CRISPR复合物的方法，以确保对于靶标识别的增强特异性和避免毒性，并且以编辑或修饰在感兴趣基因组座位中的靶位点以便改变或改善疾病或病症的状态。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关应用和引用参考本申请要求各自提交于2013年12月12日的美国临时专利申请61/915,176；61/915,192；61/915,215；61/915,107；61/915,145；61/915,148；和61/915,153的权益。前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本专利技术的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。专利
本专利技术总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的递送、工程化、优化和治疗应用，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)及其组分的基因组干扰或基因编辑。具体而言，本专利技术涉及用于递送CRISPR-Cas系统以在动物(包括哺乳动物)体内经由基因组编辑实现治疗益处的体外、离体和/或体内系统、方法和组合物。关于联邦资助研究的声明本专利技术是在由美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(Pioneer Award)(1DP1MH100706)以及同样由美国国立卫生研究院提供的基金1DP1OD009552的政府支持下完成的。美国政府享有本专利技术的某些权利。专利技术背景在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指(ZFN)、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。专利技术概述尽管在药物开发中提出了有效的治疗假设并且做出了强有力的努力，但是使用小分子治疗具有强遗传贡献的疾病仅取得了数目有限的成功。因此，迫切需要能够修饰受疾病影响的细胞和组织内的核酸的治疗策略的具替代性且稳健的系统。将CRISPR-Cas系统加入治疗性基因组工程化方法的组库中显著简化了方法学并且加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关的遗传因子进行编目和映射，开发遗传疾病的动物模型以及开发安全的、有效的治疗替代方案的能力。为了有效而无有害作用地利用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化、优化和细胞类型/组织/器官特异性递送等方面是至关重要的，这些方面是所要求的本专利技术方面。本专利技术的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。示例性CRISPR复合物可以包括与指导序列复合的CRISPR酶(例如，Cas9)，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。申请人已经优化了CRISPR-Cas基因组工程化系统的组分，包括使用来自金黄色葡萄球菌的SaCas9。不同递送手段可以用于将CRISPR-Cas系统的组分离体和/或体内地递送至细胞、组织和器官。申请人已经将CRISPR-Cas系统组分(例如，包含SaCas9)有效地包装进病毒递送载体(例如，AAV)中，并且已经证明它可以用于体内地修饰哺乳动物细胞中的内源基因组序列。申请人专利技术的关键特征在于它有效地解决了(治疗组分的)体内递送效率低和同源定向修复(HDR)效率低的挑战，并且具体而言，与共递送相关联的挑战通过小Cas9(来自金黄色葡萄球菌的SaCas9)得到了解决，该小Cas9可以被容易地包装进单个腺相关病毒(AAV)载体中来表达Cas9蛋白及其相应的一种或多种sgRNA两者。此外，重要的是，申请人已经表明引入小SaCas9已经将进行HDR所需的病毒载体数目从3个载体降至2个载体。在本专利技术的方面中，粒子可以用于递送CRISPR-Cas系统的一种或多种组分。并且有待接触的粒子的数目可以是一或二。在一方面，本专利技术提供了使用CRISPR-Cas系统的一个或多个元件的方法。本专利技术的CRISPR复合物为修饰基因组座位中的靶多核苷酸提供了有效手段，其中该基因组座位与突变相关，包括与异常蛋白质表达或与疾病状况或状态相关联的突变。本专利技术的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)基因组座位内的靶多核苷酸，包括这样的靶座位的编码、非编码或调节元件内的靶多核苷酸。正因为如此，本专利技术的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑、基因治疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。本专利技术的方面涉及在具备具有优化活性的指导RNA的CRISPR-Cas9系统中的、具有改进的靶向特异性的、在长度上小于野生型Cas9酶的Cas9酶和编码它的核酸分子、和嵌合的Cas9酶、以及改进Cas9酶的靶特异性或设计CRISPR-Cas9系统的方法，所述方法包括设计或制备具有优化活性的指导RNA和/或选择或制备具有比野生型Cas9更小的尺寸或长度的Cas9酶，由此将编码它的核酸包装到更高级的递送载体(因为在该递送载体中对它的编码少于野生型Cas9)中，和/或产生嵌合Cas9酶。还提供了本专利技术的序列、载体、酶或系统在医学中的用途。还提供了它们在基因或基因组编辑中的用途。在本专利技术中，该Cas酶可以是野生型Cas9，包括任何天然存在的细菌Cas9。Cas9直向同源物典型地共享3-4个RuvC结构域和一个HNH结构域的通用结构。最5’的RuvC结构域切割非互补链，而HNH结构域切割互补链。所有符号都是就指导序列而言的。在5’RuvC结构域中的催化残基是通过该感兴趣的Cas9与其他Cas9直向同源物(来自化脓链球菌II型CRISPR位点、嗜热链球菌CRISPR位点1、嗜热链球菌CRISPR位点3、以及凶手弗朗西斯菌(Franciscilla novicida)II型CRISPR位点)的同源性比较而鉴定的，并且保守性Asp残基(D10)被突变为丙氨酸以将Cas9转化成互补链切口酶。类似地，在HNH结构域中的保守性His和Asn残基被突变为丙氨酸以将Cas9转化为非互补链切口酶。在一些实施例中，这两组突变都可以进行，将Cas9转化为非切割酶。因此，该Cas酶可以是野生型Cas9，包括任何天然存在的细菌Cas9。该CRISPR、Cas或Cas9酶可以针对人类细胞(包括特定类型的人类细胞)进行密码子优化，或是修饰形式，包括任何嵌合体、突变体、同源物或直向同源物。在本专利技术的另外方面，Cas9酶可以包含一个或多个突变，并且可以用作具有或不具有与功能结构域融合的通用DNA结合蛋白。这些突变可以是人工引入的突变或获得性和丢失性功能突变。这些突变可以包括但不限于分别在RuvC和HNH催化结构域中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，该方法包括对所述基因组座位的编码元件、非编码元件或调节元件内的靶序列进行操纵，该操纵包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：(A)‑I.CRISPR‑Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.编码Cas9的多核苷酸序列，该Cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA，或者(B)I.多核苷酸，其包含：(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.编码Cas9的多核苷酸序列，以及III.包含tracr序列的多核苷酸序列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.12 US 61/915,145;2013.12.12 US 61/915,148;1.一种为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，该方法包括对所述基因组座位的编码元件、非编码元件或调节元件内的靶序列进行操纵，该操纵包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：(A)-I.CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.编码Cas9的多核苷酸序列，该Cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA，或者(B)I.多核苷酸，其包含：(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.编码Cas9的多核苷酸序列，以及III.包含tracr序列的多核苷酸序列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，并且编码Cas9的多核苷酸序列是DNA或RNA。2.如权利要求1所述的方法，其中该Cas9是SaCas9。3.如权利要求1或2所述的方法，其中对编码该Cas9的序列、该指导序列、tracr配对序列或tracr序列进行编码的多核苷酸是RNA并且经由脂质体、纳米粒子、细胞穿透肽、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送。4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其中该多核苷酸被包含在含有一种或多种载体的载体系统中。5.一种为与真核生物或非人类生物中的基因组座位相关的疾病建模的方法，该方法包括对所述基因组座位的编码元件、非编码元件或调节元件内的靶序列进行操纵，该操纵包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含病毒载体系统，该载体系统包含一种或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码Cas9的酶编码序列上，该Cas9任选地包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，或者(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至(a)指导序列，该指导序列能够杂交到该靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码Cas9的酶编码序列，以及III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列；(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9；并且其中该Cas9优选是SaCas9。6.如权利要求5所述的方法，其中该病毒载体的一种或多种可以经由脂质体、纳米粒子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送。7.一种治疗或抑制真核生物或非人类生物的由基因组座位中的一个或多个突变所引起的病症或疾病的方法，该方法包括对有需要的受试者或非人类受试者的靶序列中的所述基因组座位的编码元件、非编码元件或调节元件内的靶序列进行操纵，该操纵包括通过操纵该靶序列来修饰该受试者或非人类受试者，并且其中该病症或疾病对于通过操纵该靶序列进行的治疗或抑制是敏感的，该方法包括提供包含以下项的治疗：递送包含AAV或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含一种或多种AAV或慢病毒载体，该一种或多种AAV或慢病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中在表达时该靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非天然存在的或工程化的组合物包括：(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列上，其中该多核苷酸序列包含(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的该靶序列上，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码Cas9的酶编码序列上，该Cas9包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9，或者(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的靶序列上，和(b)至少一种或多种tracr配对序列，II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码Cas9的酶编码序列，以及III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的Cas9；并且其中该Cas9优选是SaCas9。8.如任一前述权利要求所述的方法，其中该方法是在体外、离体地或在体内进行的。9.如任一前述权利要求所述的方法，包括诱导表达。10.如权利要求1所述的方法，其中该病症或疾病是眼病。11.如权利要求10所述的方法，其中该眼病是色素性视网膜炎或全色盲。12.如权利要求4到8中任一项所述的方法，其中该病毒载体是AAV或慢病毒载体。13.一种递送如任一前述权利要求所述的Cas9的方法，该方法包括向细胞递送编码该Cas9的mRNA。14.如权利要求1到13中任一项所述的方法，其中通过将编码该Cas9的mRNA递送至该细胞而将编码该Cas9的多核苷酸或序列递送至该细胞。15.一种制备如权利要求7所述的AAV或慢病毒载体的方法，该方法包括将含有编码该AAV或慢病毒的一种或多种核酸分子的或基本上由该一种或多种核酸分子组成的一种或多种质粒转染到AAV感染的或慢病毒感染的细胞中，并且提供对于该AAV或慢病毒的复制和包装必须的AAV AAV或慢病毒rep和/或cap和/或辅助核酸分子。16.一种制备用于在权利要求7所述的方法中使用的AAV或慢病毒载体的方法，该方法包括将含有编码该AAV或慢病毒的一种或多种核酸分子的或基本上由该一种或多种核酸分子组成的一种或多种质粒转染到AAV感染的或慢病毒感染的细胞中，并且提供对于该AAV或慢病毒的复制和包装必须的AAV AAV或慢病毒rep和/或cap和/或辅助核酸分子。17.如权利要求15或16所述的方法，其中对于该AA...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛乐，大卫·本杰明·图里茨·考克斯，马蒂亚斯·海登赖希，兰德尔·杰弗里·普拉特，卢卡斯·斯维齐，张锋，
申请(专利权)人：布罗德研究所有限公司，麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国;US