整合子In1287制造技术

本发明专利技术公开了一种新的整合子In1287，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一种耐药肺炎克雷伯菌KP1262的基因组中发现的。因此本发明专利技术的上述整合子的发现一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与肺炎克雷伯菌耐药性密切相关的整合子In1287。
技术介绍
肺炎克雷伯菌是一种常见的革兰阴性条件致病菌，为医院内感染的主要病原菌，易感患者群广泛。在医院感染中，可通过患者间或经呼吸机、静脉通路及医护人员的途径传播，克雷伯杆菌肺炎病情严重，死亡率极高。起病急，主要症状为寒战、高热，呼吸道症状为咳嗽、咳痰、呼吸困难及胸痛。典型痰液为粘稠血性，黏液样或砖红色胶冻样或果酱样，无腥臭，临床描述为无核小葡萄干性胶冻样痰，痰量多。发病早期即可出现毒血症表现、休克，应警惕本病可能。细菌耐药机制-整合子(integron)系统得到研究者们的广泛注意，并取得了很大的发展。整合子通过整合酶的作用，具有捕获外源基因并使之成为功能性基因表达的单位，起源于基因的突变，导致细菌具有耐药及多重耐药特性，造成细菌多重耐药性的传播。在整合子介导细菌的耐药机制中，一型整合子起着非常重要的作用。大部分的耐药基因水平传播都是由I型整合子介导的。因此调查研究肺炎克雷伯菌、扩增I型整合子基因和检测I型整合子分子流行病学情况对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为In1287，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子含有catB3和aacA4基因盒。含有该整合子的菌株KP1262对多种抗生素药物具有抗性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、磺胺类抗生素。常见的氨基糖苷类抗生索包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星。常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶银、磺胺醋酰(SA)、以及复方新诺明(甲氧苄啶+磺胺甲恶唑)。本专利技术的整合子是通过以下方法获得的：(1)在台州市立医院神经外科病人痰液培养阳性的标本中分离出1株对妥布霉素和阿米卡星耐药的细菌；(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯菌，将其命名为KP1262；同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性；所述抗生素阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素和磺胺甲恶唑；(3)将KP1262菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒；(4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度约3,160bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的序列。进一步，步骤(4)的具体操作步骤如下：以步骤(3)获得的质粒为模板，利用表1中的引物进行DNA片段扩增：表1引物序列将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的片段，然后将该DNA片段按(4)操作测序。分析SEQ ID NO.1所示的序列，发现该序列与传统的整合子的结构不同，SEQ ID NO.1中含有的基因盒位于整合子3’-CS序列的下游，而传统的基因盒位于整合子5’-CS和3’-CS序列中间。为了证明SEQ ID NO.1中的基因盒确实作为整合子的一部分随着整合子的转移而转移，本专利技术利用细菌质粒转导实验来证明SEQ ID NO.1是一个完整的整合子。具体操作如下：将KP1262菌株与E.coli J53AzR(对叠氮化钠耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钠(300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板筛选接合子，一方面提取接合子DNA，测序，验证SEQ ID NO.1作为一个整体存在；另一方面将接合子做药敏试验，证明受体菌拥有供体菌的抗性。其中，所用阿米卡星可用下列药物代替：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星、复方新诺明、磺胺甲恶唑。本专利技术的整合子序列可以商业合成。本专利技术的优点和有益效果：(1)本专利技术首次发现了序列为SEQ ID NO.1的整合子In1287，该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。(2)本专利技术整合子序列的发现，一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。附图说明图1为本专利技术的整合子In1287的结构示意图。具体的实施方式下面结合具体的实施例进一步说明本专利技术，本专利技术的实施例仅用于解释本专利技术，并不意味着限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1整合子In1287的鉴定1、KP1262菌株的分离和鉴定1.1材料细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他定、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉索、磺胺甲恶唑。补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验)：纸片来源于英国Oxoid公司，有复方新诺明(30μg)、奈替米星(30μg)。1.2方法仪器鉴定：将台州市立医院重症监护室病人脓液培养阳性的菌株转种到血平板上分离培养(在35℃含5％CO2孵育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在VITEK 2上机作细菌鉴定与药敏试验。补充药敏试验：将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上复方新诺明、奈替米星纸片，在35℃含5％CO2孵育箱中培养16-18h后，按CLSI 2015标准鉴定药敏结果。1.3结果1.3.1仪器鉴定结果经VITEK 2微生物分析仪鉴定为肺炎克雷伯菌，鉴定概率为99％，将其命名为KP1262。1.3.2药敏实验结果药敏实验结果表明，KP1262菌株对于以下药物产生抗性：阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、奈替米星、复方新诺明、磺胺甲恶唑。2、整合子In1287的获取和鉴定2.1方法2.1.1KP1262菌株的质粒提取采用TaKaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作为PCR模板，-20℃冰箱保存备用。2.1.2整合子序列扩增以上述提取的质粒为模板，利用表1中的引物进行DNA片段扩增。将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的片段，以常规方法将扩增片段分别与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。2.1.3序列拼接将上述扩增出的DNA片段利用Con本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为In1287。

【技术特征摘要】
1.一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为In1287。2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制备过程中使用的载体质粒为pMD19-T载体。4.一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述接合细菌是由KP1262菌株与E.coliJ53 AzR菌株制备。5.一种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子；所述重组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E.coli TOP10菌株中制备而成。6.权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在台州市立医院神经外科病人痰液培养阳性的标本中分离出1株对妥布霉素和阿米卡星耐药的细菌；(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯菌，将其命名为KP1262；同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性；所述抗生素阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、庆大...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冬国，杨林军，陈佳玉，
申请(专利权)人：王冬国，
类型：发明
国别省市：浙江;33