一种利用重组表达iRFP的结核分枝杆菌测定抗结核药物最低抑菌浓度的方法技术

本发明专利技术涉及一种药物疗效的检测方法，特别涉及一种利用重组表达iRFP的结核分枝杆菌测定抗结核药物最低抑菌浓度的方法。本发明专利技术提供一种抗结核药物的MIC测定方法，其特征是，根据生长曲线及时间‑荧光强度曲线以及不同浓度抗结核药物作用下本发明专利技术所述结核分枝杆菌菌株不同时间点荧光强度检测，确定加入药物后4天可以判断MIC结果，根据不同浓度的待测药物导致荧光的变化计算试验药物的MIC值。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种药物疗效的检测方法，特别涉及一种利用重组表达iRFP的结核分枝杆菌测定抗结核药物最低抑菌浓度的方法。
技术介绍
：结核病是严重的全球性健康问题。严峻的结核病形势要求加速新型抗结核药物的研究开发。快速、低廉、高通量的筛选方法能缩短筛选周期，加快新药开发的进程。最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)是指抑制细菌生长所需药物的最低浓度。MIC测定是新药筛选的第一步和关键一步，传统的结核分枝杆菌MIC测定方法有固体琼脂培养基法、液体培养基法等，由于受结核分枝杆菌生长缓慢的制约，至少需要4周的时间得到结果。快速的BACTEC 460系统的高成本、药物样品需要量多以及放射性等问题限制了其在药物筛选评价中的应用。快速显色法是基于氧化还原指示剂能被活细胞线粒体中脱氢酶还原而产生可见的颜色变化的原理。甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色分析法首先被Mosmann于1983年用于哺乳动物细胞生长存活的测定，MTT被活细胞还原成甲瓒颗粒，甲瓒颗粒的形成量与活细胞数量及细胞活性状态呈正比关系，提示MTT可用来反映细菌的生长和存活状况，可用于抗菌药物敏感性测定。与MTT相比，Alamar blue的水溶性好，对细胞无损伤，在培养基中性质稳定，不易自发地产生氧化还原反应。现已应用于革兰氏阴性杆菌、阳性球菌、丝状真菌等的敏感性试验。Alamar blue法是目前抗结核药物MIC测定中最常用的方法。无论是MTT法，还是Alamar blue法，在测定抗结核药物的MIC时，都需要7-8天的时间，并需要额外加入试剂如MTT或Alamar blue。荧光/生物发光标记物标记结核分枝杆菌进行MIC测定是一种新的技术。红外荧光蛋白是指最大激发与吸收波长在684/708nm之间的荧光蛋白，其可在哺乳动物体内稳定表达且不受胆绿素、血液的自发荧光的影响，广泛的应用于活体动物的成像的研究。IFP1.4是最早应用于体内成像的近红外荧光蛋白。而iRFP是IFP1.4基础上通过对细菌光敏色素结构改造获得的新型光敏色素型荧光蛋白，是最新发展的稳定的近红外荧光蛋白。iRFP作为标记物已应用于肿瘤细胞，干细胞等体外高通量的筛选实验。迄今为止，尚未见有国内外将iRFP标记结核分枝杆菌并应用于抗结核药物MIC检测的相关报道。本专利技术提供一种新颖、快速、简便的抗结核药物MIC测定方法，缩短现有MIC测定方法的检测时间，简化测定方法，并节约检测成本。
技术实现思路
本专利技术提供一种重组质粒pMV361-iRFP。本专利技术还提供重组质粒pMV361-iRFP的构建方法，其特征是，包括以下步骤：以质粒piRFP为模板，聚合酶链式反应扩增iRFP基因，将扩增得到的目的片段与pMV361载体进行双酶切后连接，经转化、提取质粒DNA、酶切测序验证等步骤，得到重组质粒pMV361-iRFP。本专利技术提供用所述的重组质粒pMV361-iRFP构建的表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。本专利技术还提供所述重组表达iRFP的结核分枝杆菌菌株构建方法，其特征是，包括以下步骤：将构建的重组质粒pMV361-iRFP电转化至结核分枝杆菌H37Rv标准株中，培养结核分枝杆菌得稳定表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。优选的本专利技术所述的构建方法，其特征是，包括以下步骤：将构建的重组质粒pMV361-iRFP电转化至结核分枝杆菌H37Rv标准株中，37℃7H11固体培养基培养21天后，从卡那霉素浓度为25μg/ml的7H11固体培养基中挑取单克隆菌落，磨菌器研磨后，移至卡那霉素浓度为50μg/ml的7H9液体培养基中200r.p.m/min震荡培养，隔日5000g离心收集细菌更换培养基，同时取样检测OD570与荧光强度的变化。直至荧光强度随着OD570的增长而增长且呈线性关系，获得稳定表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。本专利技术还提供所述结核分枝杆菌菌株在检测抗结核药物的疗效中的应用。本专利技术还提供一种抗结核药物的疗效测定方法，其特征是，使用本专利技术所述结核分枝杆菌菌株和抗结核药物进行接触，对不同时间点菌株发出的荧光强度进行检测，根据荧光强度计算抗结核药物的疗效。本专利技术提供一种抗结核药物的MIC测定方法，其特征是，根据生长曲线及时间-荧光强度曲线以及不同浓度抗结核药物作用下本专利技术所述结核分枝杆菌菌株不同时间点荧光强度检测，确定加入药物后4天可以判断MIC结果，根据不同浓度的待测药物导致荧光的变化计算试验药物的MIC值。以下是本专利技术名词术语的解释pMV361(大肠杆菌分枝杆菌穿梭表达载体)iRFP(the infrared fluorescent protein iRFP是IFP1.4基础上通过对细菌光敏色素结构改造获得的新型光敏色素型荧光蛋白)结核分枝杆菌H37Rv标准株(Mycobacterium tuberculosis结核分枝杆菌国际标准株，广泛应用于抗结核药物敏感性测试中)在高浓度卡那霉素筛选压力下，筛选获得稳定表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。(从卡那霉素浓度为25μg/ml的7H11固体培养基中挑取单克隆菌落，磨菌器研磨后，移至卡那霉素浓度为50μg/ml的7H9液体培养基中200r.p.m/min震荡培养，隔日5000g离心收集细菌更换培养基，同时取样检测OD570与荧光强度的变化。荧光强度随着OD570的增长而增长且呈线性关系，则认定为稳定表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。应用高浓度的卡那霉素目的是筛选出含iRFP重组表达质粒的菌株。)抗结核药物的MIC(MIC＝Minimal inhibitory concentration，最低抑菌浓度。即抑制结核分枝杆菌生长所需的最低药物浓度)抗结核药物异烟肼(soniazid，INH)、利福平(Rifampicin，RFP)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)、莫西沙星(Moxifloxcin，Mfx)、贝达喹啉(TMC207)、链霉素(Streptomycin，SM)、阿米卡星(Amikacin，Am)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LFX)、利奈唑胺(Linezolid，LZD)本专利技术的主要技术方案包括以下方面：1)以pMV361为载体的iRFP重组表达质粒的构建以质粒piRFP为模板，聚合酶链式反应扩增iRFP基因，将扩增得到的目的片段与pMV361载体进行双酶切后连接，经转化、提取质粒DNA等步骤，得到重组质粒pMV361-iRFP后，酶切鉴定并进行测序；2)iRFP重组表达结核分枝杆菌菌株的构建将构建的重组质粒pMV361-iRFP电转化至结核分枝杆菌H37Rv标准株中，液体培养结核分枝杆菌，诱导iRFP近红外荧光蛋白表达，应用小动物活体成像IVIS Spectrum系统检测重组结核分枝杆菌菌株iRFP的表达量；3)稳定表达iRFP的结核分枝杆菌菌株的筛选从卡那霉素浓度为25μg/ml的7H11固体培养基中挑取单克隆菌落，磨菌器研磨后，移至卡那霉素浓度为50μg/ml的7H9液体培养基中200r.p.m/min震荡培养，隔日5000g离心收集细菌更换7H9培养基，同时取样检测OD570与荧光强度的变化。荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒pMV361‑iRFP。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pMV361-iRFP。2.权利要求1所述重组质粒pMV361-iRFP的构建方法，其特征是，包括以下步骤：以质粒piRFP为模板，聚合酶链式反应扩增iRFP基因，将扩增得到的目的片段与pMV361载体进行双酶切后连接，经转化、提取质粒DNA、酶切测序验证等步骤，得到重组质粒pMV361-iRFP。3.用权利要求1所述的重组质粒pMV361-iRFP构建表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。4.权利要求3所述重组表达iRFP的结核分枝杆菌菌株构建方法，其特征是，包括以下步骤：将构建的重组质粒pMV361-iRFP电转化至结核分枝杆菌H37Rv标准株中，培养结核分枝杆菌得稳定表达iRFP的结核分枝杆菌菌株。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征是，包括以下步骤：将构建的重组质粒pMV361-iRFP电转化至结核分枝杆菌H37Rv标准株中，37℃7H11固体培养基培养21天后，从卡那霉素浓度为25μg\...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆宇，何畔，徐建，陈效友，王彬，付雷，朱慧，郭少晨，
申请(专利权)人：北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11