本发明专利技术公开了一种中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列及应用，申请人将猪丹毒疫苗株G4T10和GC42的DNA聚合酶IV的基因序列与猪丹毒野毒株的进行比对，发现其存在区别。中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列为SEQ ID NO.1所示。设计针对猪丹毒弱毒疫苗株的特异性引物，并结合猪丹毒种特异性引物可快速鉴定中国猪丹毒弱毒疫苗株和野毒株，适合各种样品的大批量检测，为快速检测猪丹毒临床分离株并鉴别诊断野毒株和疫苗株提供了新的技术手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及家畜传染病鉴别诊断试剂制备
，具体涉及一种中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列及应用。
技术介绍
红斑丹毒丝菌，俗称猪丹毒杆菌，为革兰氏阳性小杆菌，在自然界中广泛存在，目前在哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类动物中均有分离到的报道。红斑丹毒丝菌会造成多种家畜发生丹毒，其中尤其对于猪和火鸡的危害最为严重，同时也可以造成人类感染发病(类丹毒)。猪丹毒主要表现为猪的败血症、心内膜炎和多发性关节炎等，给养猪业带来巨大经济损失。我国在上世纪70年代相继培育出猪丹毒弱毒疫苗G4T10株和GC42株，随着80年代弱毒疫苗的推广，猪丹毒弱毒疫苗为猪丹毒疫情的控制做出了重要贡献。但是动物疫病的净化不仅需要弱毒疫苗更需要区别野毒株和疫苗株的诊断方法作为技术支持。近年来分子生物学发展迅速，PCR技术已经成为鉴定病原微生物的重要方法。目前对于病原菌的疫苗株和野毒株进行区分的PCR法已经在布鲁氏杆菌病、结核等疫病中得到应用。目前已经出现了几种鉴定红斑丹毒丝菌的PCR方法，但是目前尚缺乏快速区分猪丹毒疫苗株和野毒株的PCR法。鉴于此，申请人将猪丹毒疫苗株G4T10和GC42的DNA聚合酶IV基因进行了克隆、测序和分析，发现疫苗株该基因序列与野毒株存在差异。据此我们设计了猪丹毒疫苗株的特异性引物，结合猪丹毒杆菌的种特异性引物，我们建立起一种快速检测并同时区分猪丹毒疫苗株和野毒株的双重PCR法及相应的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。该序列在中国猪丹毒弱毒疫苗株G4T10和GC42中特异性的存在，可用于区别中国猪丹毒弱毒疫苗株和野毒株。本专利技术的另一个目的在于提供基于中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列设计的引物。优选的，其引物序列为：引物vaccine-F序列：5’-AGTGATGAAACTGATTCGTGCTC-3’引物vaccine-R序列：5’-GCCTAAATTAAACCACTTGCACACA-3’。本专利技术的最后一个目的在于提供中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列或基于其设计的引物在区分猪丹毒野毒株和中国猪丹毒弱毒疫苗株中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：申请人将猪丹毒疫苗株G4T10和GC42的DNA聚合酶IV的基因序列与猪丹毒野毒株的进行比对，发现其存在区别。中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列为SEQ ID NO.1所示。本专利技术的保护内容还包括基于SEQ ID NO.1所示序列设计的引物，优选的，设计猪丹毒疫苗株特异性引物如下：引物vaccine-F序列：5’-AGTGATGAAACTGATTCGTGCTC-3’引物vaccine-R序列：5’-GCCTAAATTAAACCACTTGCACACA-3’。中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列或基于其设计的引物在区分猪丹毒野毒株和中国猪丹毒弱毒疫苗株中的应用，包括利用目前的常规手段检测待测菌株中是否含有SEQ IDNO.1所示序列，或是基于SEQ ID NO.1所示序列设计特异性引物用于检测待测菌株是否含有SEQ ID NO.1所示序列。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术根据猪丹毒弱毒疫苗DNA聚合酶IV序列突变区域，设计针对猪丹毒弱毒疫苗株的特异性引物，并结合猪丹毒种特异性引物建立了快速检测猪丹毒临床分离株并同时区别猪丹毒弱毒疫苗株和野毒株的双重PCR方法，在2h内即可完。猪丹毒疫苗株可以同时扩增出453bp和937bp片段，猪丹毒野毒株仅能扩增出937bp片段。而大肠杆菌、副猪嗜血杆菌等没有扩增出任何目的片段，证实了本专利技术双重PCR检测方法具有较好的特异性。本专利技术具有高度的敏感性，最低检测极限是50fg的细菌DNA，基于上述双重PCR快速检测方法研制的试剂盒，适合各种样品的大批量检测，为快速检测猪丹毒临床分离株并鉴别诊断野毒株和疫苗株提供了新的技术手段。附图说明图1为三种样品经PCR扩增后产物的电泳图。其中泳道M、1、2、3、4分别为分子标记物、猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株、猪丹毒弱毒疫苗株GC42株、猪丹毒强毒流行株SE38和阴性对照。图2为本专利技术的特异性检验结果电泳图。其中泳道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15分别为分子标记物、猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株、猪丹毒弱毒疫苗株GC42株、猪丹毒强毒流行株SE38、猪丹毒经典强毒株C43-5株、胸膜肺炎放线杆菌JL03株、多杀性巴氏杆菌E0630株、大肠杆菌PCN033株、副猪嗜血杆菌SH0165株、猪霍乱沙门氏菌C500株、枯草芽孢杆菌BS168株、粪肠球菌ATCC29212株、乳酸乳球菌MG1363株、马链球菌兽疫亚种ST171株、猪链球菌R61株、阴性对照。图3为本专利技术引物的灵敏度检验结果电泳图。其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株DNA含量为50ng、5ng、500pg、50pg、5pg、500fg、50fg、5fg。M，分子标记物。图4本方法对于猪丹毒的临床分离株的PCR扩增产物电泳检测结果。泳道1-34分别为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株、GC42株、流行强毒株SE38、经典强度株C43-5株、临床分离株041-860；M，分子标记物。图5日本学者建立的基于SNP的区分猪丹毒野毒株和疫苗株的方法的检测结果。ERH_0001、ERH_0543、ERH_0636、ERH_1398、ERH_1449,基于SNP的PCR法中的被检基因；泳道1-34分别为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株、GC42株、猪丹毒流行强毒株SE38、猪丹毒经典强度株C43-5株、临床分离株041-860；M，分子标记物。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列或基于其设计的引物在区分猪丹毒野毒株和中国猪丹毒弱毒疫苗株中的应用：1材料与方法1.1菌株猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株(以下简称G4T10株)、猪丹毒弱毒疫苗株GC42株(以下简称GC42株)，本地强毒流行株SE38(以下简称SE38株，见文献“湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析”)为分离于湖北的菌株，经鉴定为强毒力流行株，以上菌株均由农业微生物学国家重点实验室提供。1.2试剂10×PCR buffer(即10倍稀释PCR缓冲液)、dNTPs Mixture、Taq DNA聚合酶均购自于TAKARA公司，引物vaccine-F序列：5’-AGTGATGAAACTGATTCGTGCTC-3’引物vaccine-R序列：5’-GCCTAAATTAAACCACTTGCACACA-3’引物ER1、ER2序列见文献“Broth cultivation-PCR combination assay for本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种中国猪丹毒弱毒疫苗株的特异性序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。2.针对权利要求1所述特异性序列设计的引物。3.根据权利要求2所述的引物，其引物为：vaccine-F： 5’-AGTGATGAAACTGATTCGTGCTC-3’vaccine-R： 5’-GCCTAAATTAAACCACTTGCACACA-3’。4.权利要求1所述的序列或权利要求2所述的引物在区分中国猪丹毒弱毒疫苗株和野毒株中的应用。5.一种区分国猪丹毒弱毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，朱伟峰，吴超，康超，蔡承志，王雅，李敬涛，张强，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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