一种基于TaMKK3‑A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于TaMKK3‑A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法，该方法是基于小麦4AL染色体休眠性候选基因TaMKK3‑A基因的功能性SNP开发了一个dCAPS标记MKKAC，具体为，在CAPS标记基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，从而在TaMKK3‑A基因的与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记处引入一个HpyCH4IV酶切位点，使得抗穗发芽的小麦材料扩增出来的谱带中多一个HpyCH4IV酶切位点，而感穗发芽的小麦材料中无该酶切位点。将标记用于小麦穗发芽抗性分子标记辅助育种，可以有效区分穗发芽抗性不同的材料，简化了SNP的检测技术，降低了检测的成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是小麦分子育种的
，尤其涉及的是一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法。
技术介绍
小麦穗发芽(Pre-harvest sprouting，PHS)是指小麦临近收获前遭遇阴雨或者高温高湿天气导致籽粒直接在穗部发芽的现象。小麦发生收获前穗发芽会严重降低产量及品质的稳定性(Groos等，2002；Chang等，2010)。如果收获前遭遇持续阴雨天气时间越长，则穗发芽危害更严重。因此，培育穗发芽抗性持续性强的小麦品种有助于降低这种风险。挖掘更多的抗穗发芽基因，开发功能标记，进行不同抗穗发芽基因的聚合将有助于培育穗发芽抗性持续性强的小麦品种。众多学者研究结果均表明，小麦21条染色体均有调控小麦穗发芽抗性的相关QTL的报道。其中小麦4AL染色体上存在稳定的穗发芽抗性主效QTL，紧密连锁标记主要有Xbarc170、Xgwm397、Xgwm269、Xgwm937、Xgwm894、Xgwm637、Xzxq118和Xhbe03(Mares等，2005；Kottearachchi et al.2006；Torada等，2008；Chen等，2008；Ogbonnaya等，2008；Imtiaz等，2008；Munkvold等，2009；Singh等，2010；Liu等，2011；Knox等，2012；Kulwal等，2012；Kumar等，2015)。Torada等(2016)利用图位克隆的方法已鉴定出位于该QTL区域的候选基因TaMKK3-A，其编码蛋白产物属于MKK3蛋白激酶家族。序列分析发现，位于该基因起始密码子下游660bp处(不包含内含子)在穗发芽抗性不同的品种间存在单核苷酸突变(SNP)，为功能性SNP。其中抗穗发芽亲本SNP为C碱基，对应的氨基酸为天冬酰胺(Asn)；感穗发芽亲本SNP为A碱基，对应的氨基酸为赖氨酸(Lys)。该处功能性SNP可用于小麦穗发芽抗性分子辅助育种。然而，目前单核苷酸检测技术成本较高，所用仪器较昂贵，不适合大批量材料的检测。基于此，本专利技术人对TaMKK3-A基因的功能性SNP进行了dCAPS标记的转化，简化了该SNP的检测技术，降低了检测的成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法，以提供一种新的小麦穗发芽抗性分子标记辅助育种方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记，所述dCAPS分子标记为将TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换成G，所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记位于TaMKK3-A基因CDS序列的第660bp处，所述相邻的下游碱基C位于TaMKK3-A基因CDS序列的第661bp处，所述TaMKK3-A基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示，开发的dCAPS分子标记命名为MKKAC。一种利用上述基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记检测小麦穗发芽抗性的方法，包括以下步骤：(1)提取待测小麦基因组DNA；(2)以步骤(1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR扩增，获得一次扩增产物，所述一次扩增产物为包含所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记及其上下游延伸序列的长序列，此处长序列为与下述的二次扩增产物的较短序列而言，其长度大于常规PCR可扩增的最小长度。(3)以步骤(2)的一次扩增产物为模板，设计dCAPS标记引物，并在dCAPS标记引物中引入错配碱基，将所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换成G，获得二次扩增产物；(4)将步骤(3)的二次扩增产物用HpyCH4IV内切酶进行酶切，获得酶切产物，所述酶切产物包含的条带多的品种为抗穗发芽品种，对应的SNP为C碱基类型，所述酶切产物包含的条带少的品种为感穗发芽品种，对应的SNP为A碱基类型。优选地，所述基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记检测小麦穗发芽抗性的方法，包括以下步骤：(1)提取待测小麦基因组DNA；(2)以步骤(1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR扩增，获得一次扩增产物，所述TaMKK3-A基因组标记引物如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，扩增获得的一次扩增产物的序列如SEQ ID NO.2所示；(3)以步骤(2)的一次扩增产物为模板，利用dCAPS标记引物进行第二次PCR扩增，获得二次扩增产物，所述dCAPS标记引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；(4)将步骤(3)的二次扩增产物用HpyCH4IV内切酶进行酶切，获得酶切产物，将酶切产物进行电泳验证，其中，酶切产物包含的条带多的待测小麦品种为抗穗发芽品种，酶切产物包含的条带少的待测小麦品种为感穗发芽品种。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法，该方法是基于小麦4AL染色体休眠性候选基因TaMKK3-A基因的功能性SNP开发了一个dCAPS标记MKKAC，该标记用于小麦穗发芽抗性分子标记辅助育种，可以有效区分穗发芽抗性不同的材料，简化了SNP的检测技术，降低了检测的成本。附图说明图1为TaMKK3-A基因功能标记MKKAC不同等位基因类型的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。具体实施方式实施例11材料本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所用种质资源，均可从国家种质资源库获得。2方法2.1MKKAC标记在260份小麦品种资源中的有效性验证2.1.1穗发芽表型检验2012-2015年期间，选取260份小麦品种，进行穗发芽表型检验，具体步骤如下：(1)种子萌芽指数(GI)测定于小麦蜡熟期分别收获小麦主茎穗材料，室内风干2天，立即存放于-20℃冰箱以维持种子的休眠性，待全部试验材料收获完毕，一并进行发芽试验。选取10个成熟期一致的主茎穗，手工脱粒，每个材料取50粒进行种子发芽试验，2次重复。籽粒腹沟朝下摆放在培养皿内，培养皿内加9mL无菌水，置于人工气候培养箱(20℃，光照14h，黑暗10h，湿度80％)，24小时候后开始统计每个培养皿萌发种子数，于每天同一时间统计萌芽数并剔除发芽种子(以胚部露白为萌芽鉴定标准)，3天后计算种子萌芽指数(GI)。种子萌芽指数(GI)计算公式：GI＝[(3×n1+2×n2+1×n3)/(3×N)]×100％其中n1、n2、n3是种子第1天、第2天、第3天每天所萌芽的籽粒数，N指总粒数。(2)整穗发芽率(GP)测定于小麦蜡熟后期(茎秆、叶片和麦穗全部变黄)收获每份材料10个主茎穗，室内风干1d，立即存放于-20℃冰箱以维持种子的休眠性，待收获全部材料后一并进行整穗发芽试验。先把整穗在灭菌水中充分浸泡10min，用发芽纸卷裹，保鲜袋保湿，置人工气候培养箱中(温度20℃，光周期14h昼/10h夜，相对湿度80％)培养7d。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于TaMKK3‑A基因的dCAPS分子标记，其特征在于，所述dCAPS分子标记为将TaMKK3‑A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换成G，所述TaMKK3‑A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记位于TaMKK3‑A基因CDS序列的第660bp处，所述相邻的下游碱基C位于TaMKK3‑A基因CDS序列的第661bp处，所述TaMKK3‑A基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记，其特征在于，所述dCAPS分子标记为将TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换成G，所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记位于TaMKK3-A基因CDS序列的第660bp处，所述相邻的下游碱基C位于TaMKK3-A基因CDS序列的第661bp处，所述TaMKK3-A基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种利用如权利要求1所述的基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记检测小麦穗发芽抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测小麦基因组DNA；(2)以步骤(1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR扩增，获得一次扩增产物，所述一次扩增产物为包含所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记及其上下游延伸序列的长序列；(3)以步骤(2)的一次扩增产物为模板，设计dCAPS标记引物，并在dCAPS标记引物中引入错配碱基，将所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玉磊，王升星，张海萍，常成，吴曾云，姜昊，曹佳佳，刘凯，秦朦，卢杰，司红起，马传喜，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34