本发明专利技术涉及一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物及方法。所述特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术中的检测引物基于ToCV CPm基因中的保守区域设计，通过在NCBI中进行比对分析，并结合克隆鉴定证明其具备较强的特异性，总体准确性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物及方法，属于植物保护和生物技术
技术介绍
番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)，属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)，是一类可侵染番茄、辣椒、烟草等多种作物的RNA病毒。该病毒最早在20世纪90年代首次发现于美国佛罗里达州，现已蔓延至欧洲、非洲、美洲、亚洲等世界多个地区。2004年，中国台湾首先报道了ToCV的发生，近年来，该病毒成功入侵中国内陆并迅速蔓延，北京地区于2012年鉴定出其番茄和甜椒植株上带有该病毒；随后，ToCV在山东省寿光、泰安、聊城、青岛等地发生；最新监测结果表明ToCV也已成功扩散至山西、陕西、内蒙古和浙江等地的番茄种植区。ToCV发病率高，经烟粉虱(Bemisia tabaci)、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、纹翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)传播，传播速度快，发病温室内病株率达20％-100％，感病植株减产最高达40％，给番茄等蔬菜生产造成了严重经济损失。植物病毒病素来被称为植物的“癌症”，早期监测、预警是防治其进一步扩散蔓延的重要手段之一。因此，针对ToCV建立一种准确性强、灵敏度高的检测技术有助于在病毒侵染初期(植株并未发病)完成早期诊断，提早防治，控制ToCV的暴发。检测植物病毒的方法多种多样，分子生物学方法是目前已知类别植物病毒检测的常用手段，针对ToCV，采用比较多的为普通PCR检测，检测灵敏度有限，无法满足病毒含量较低样本的准确诊断。中国专利文献CN103498010A(申请号201310474211.4)公开了一种快速检测番茄褪绿病毒的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。该专利技术还公开了一种快速检测番茄褪绿病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常规PCR检测的常规试剂。该专利技术提供的引物、试剂盒可以用于鉴定番茄褪绿病毒，以及检测待测样品中是否含有番茄褪绿病毒。该技术方案基于常规PCR进行番茄褪绿病毒检测，在灵敏度方面低于实时荧光定量PCR技术，此外在检测样本的过程中，只能对于病毒进行定性，而对于病毒具体拷贝数(copy)无法做到定量。实时荧光定量PCR可满足低拷贝病毒的检测，而目前尚未有应用该方法进行ToCV检测的报道。因此，十分有必要建立一种基于实时荧光定量PCR技术的灵敏、快速、准确检测ToCV的方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种灵敏、快速、可靠的鉴定检测番茄褪绿病毒的方法。本专利技术技术方案如下：一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术所述的一对实时荧光定量PCR检测引物是根据NCBI数据库中ToCV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因(AGN91010.1)的保守序列进行设计，并通过NCBI的Primer-BLAST进行比对，保证引物的特异性。引物序列如下：上游引物ToCVqF：CTTTCTGGATGGTTTGCGGC；SEQ ID NO.1下游引物ToCVqR：TCCCCAACCAATGGTCGTTT；SEQ ID NO.2一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取植株的总RNA；(2)以植株的总RNA为模板，利用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA；(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述特异引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；(4)将步骤(3)制得的PCR扩增产物纯化后连接至载体，转入感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒获得ToCV标准品，并按梯度稀释，制备标准曲线；(5)以步骤(2)制得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，根据检测得到的扩增曲线、熔解曲线判定待测样品是否携带病毒，根据检测得到的Ct值并结合步骤(4)制得的标准曲线计算待测样品的含病毒量。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，提取植株的总RNA，步骤如下：称取待检测的植株样品叶片0.05g，置于去除RNase的研钵中，加入液氮并研磨后，按照Trizol提取法的相关步骤进行叶片总RNA的提取(Trizol试剂购于赛默飞世尔公司 。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，反转录合成cDNA的步骤如下：取1μg总RNA样品，去除基因组DNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(购自宝生物工程有限公司)进行反转录-聚合酶链式反应合成第一链cDNA，反转录体系如下：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、RT Primer Mix 1μL、5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4μL、RNase Free dH2O 4μL，去除基因组DNA的反应液10μL；反转录条件：37℃反应15min，然后85℃反应5sec；置于-20℃保存。根据本专利技术进一步优选的，所述去除基因组DNA的反应体系如下：总RNA 2μL、5×gDNA Eraser Buffer 2μL、gDNA Eraser 1μL、RNase Free dH2O 5μL；反应条件：42℃反应2min。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，PCR反应体系如下：10×PCR Buffer(Mg2+plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL；PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min，置于4℃保存。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，标准曲线采用如下方法获得：(i)将PCR产物经纯化后连接至载体pMDTM 18-T Vector(购自宝生物工程有限公司)，然后转入大肠杆菌感受态细胞Trans 5α(购自北京全式金生物技术有限公司)，37℃过夜培养后，筛选阳性克隆，经测序正确，继续扩大培养，然后提取重组质粒；(ii)测定质粒浓度，计算出质粒浓度拷贝数，作为ToCV质粒标准品使用，计算公式：C＝A/B×6.02×1014A代表质粒浓度ng/μL，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/μL；(iii)用DNase/RNase free water对ToCV质粒标准品按照10倍的浓度梯度进行稀释，将终浓度为2.7×105-2.7×109copies/μL的5个质粒样品作为模板进行实时荧光定量PCR；仪器自动生成标准曲线，扩增效率为98％，相关系数R2＝0.9913，直线方程为：Y＝-3.37×lg(X)+44.27Y代表循环阈值即Ct值，X代表质粒初始浓度。进一步优选的，所述步骤(iii)中，实时荧光定量PCR反应体系如下：SYBR Premix Ex TaqTM II 10μL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物，其特征在于，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物，其特征在于，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取植株的总RNA；(2)以植株的总RNA为模板，利用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA；(3)以步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述特异引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；(4)将步骤(3)制得的PCR扩增产物纯化后连接至载体，转入感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒获得ToCV标准品，并按梯度稀释，制备标准曲线；(5)以步骤(2)制得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，根据检测得到的扩增曲线、熔解曲线判定待测样品是否携带病毒，根据检测得到的Ct值并结合步骤(4)制得的标准曲线计算待测样品的含病毒量。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取植株的总RNA，步骤如下：称取待检测的植株样品叶片0.05g，置于去除RNase的研钵中，加入液氮并研磨后，按照Trizol提取法的相关步骤进行叶片总RNA的提取。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反转录合成cDNA的步骤如下：取1μg总RNA样品，去除基因组DNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒进行反转录-聚合酶链式反应合成第一链cDNA，反转录体系如下：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、RT Primer Mix 1μL、5×PrimeScript Buffer 2 4μL、RNase Free dH2O 4μL，去除基因组DNA的反应液10μL；反转录条件：37℃反应15min，然后85℃反应5sec；进一步优选的，所述去除基因组DNA的反应体系如下：总RNA 2μL、5×gDNA Eraser Buffer 2μL、gDNA Eraser 1μL、RNase Free dH2O 5μL；反应条件：42℃反应2min。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL；PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁天波，褚栋，张桂健，李洁，姜德锋，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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