CD44结合肽制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质，其结合至由人类CD44基因外显子9(CD44ex9)编码的区域，以融合蛋白质并与所述蛋白质偶联，尤其涉及偶联到所述蛋白质的纳米颗粒。本发明专利技术还涉及一种生产所述蛋白质和相应的偶联纳米颗粒的方法，以及本发明专利技术所述的蛋白质在治疗和诊断癌症方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种蛋白质，其结合至由人类CD44基因外显子9(CD44ex9)编码的区域，以融合蛋白质并与所述蛋白质偶联，尤其涉及偶联到所述蛋白质的纳米颗粒。本专利技术还涉及一种生产所述蛋白质和相应的偶联纳米颗粒的方法，涉及CD44V5衍生肽，以及本专利技术所述的蛋白质和肽在治疗和诊断各种疾病方面的应用，尤其是在治疗和诊断癌症方面的应用。
技术介绍
癌症转录模式的大量研究已经导致了分子靶标的发现，以从良性肿瘤中区分出恶性肿瘤，从那些不太具备侵略性的肿瘤中区分出最具侵略性的肿瘤。癌症往往过度表达一些蛋白质，包括某些细胞表面抗原，例如，细胞表面受体。结合到这些过表达的细胞表面抗原的抗体可促进此类癌症的检测和治疗。目前已经使用了许多方法来产生针对癌细胞表面受体的抗体，所述癌细胞表面受体可用作潜在的诊断或疗法。过度表达的细胞表面受体和结合在其上的抗体的识别，为癌症疗法的发展提供了有效的途径，尤其是对那些具有不良预后且对传统疗法产生抵抗的癌症亚型而言。CD44，CA19-9和CEA均是这种过度表达的细胞表面受体，它们均被认为与肿瘤恶化和恶性肿瘤相关。CD44，是胞外基质的一种主要的粘附分子，已广泛涉及多种生理过程，包括：白细胞归位和激活，伤口愈合和细胞迁移，以及肿瘤细胞的侵袭和转移(Gijnthert et al.,1991；Nagano and Saya,2004；Ponta et al.,2003)。CD44是一种单链分子，包含一个保守的N-末端细胞外结构区，一个非保守的近膜区，一个表达变体外显子的各种组合的可变区，一个跨越区域的保守的跨膜区，以及一个保守的胞质尾。CD44基因组图谱包括在5'末端的5个恒定的外显子与在3'末端的5个恒定的外显子。小鼠CD44基因还在分子指定的V1-V10的中间包括10个外显子变体，导致共有20个外显子。人类CD44基因仅包含这10个外显子变体中的9个(V2-V10)，因而总共包含19个外显子。不同的选择性剪接生成表达外显子变体的各种组合的CD44的许多亚型(指定的外显子Vx中，x＝1-10)，所述外显子变体插在近膜区中，并构成了该分子的可变区。这些分子被指定为CD44变体(CD44v)。迄今为止，已经发现了CD44的20种亚型。然而，标准CD44亚型(CD44s)主要表达于造血细胞和普通上皮细胞的亚群中，在膜-近端胞外区插入的CD44变体被发现富含于多种人类肿瘤中，包括：结肠肿瘤，乳腺肿瘤，胃肿瘤，膀胱肿瘤，前列腺肿瘤和各种造血肿瘤。其它报道提出CD44变体表达与肿瘤恶化尤其是肿瘤细胞的淋巴扩散之间有着密切的联系。一并考虑这些观察结果，可发现它们指出了CD44变体除了在细胞粘附和迁移中更常规的功能外，还在肿瘤起始阶段和癌细胞保持阶段中具有重要功能。除了CD44在癌症中的作用外，CD44也被建议作为自身免疫性疾病中的潜在靶标。据报道(Hale et al.,1992)，CD44蛋白质或肽或衍生物的给药可被用于治疗各种自身免疫疾病。基于已经确立的CD44在癌症和自身免疫疾病中作用，直接针对CD44的各种变种区域的单克隆抗体也已经得以生产，作为用于CD44相关病症的诊断和治疗的潜在试剂。Seiter等人报道了直接针对大鼠腺癌的CD44表面蛋白质的特定转移变体的mAbs(Seiter et al.,1993)。这些抗体拟被用于生产用于免疫调节紊乱的治疗性处理的免疫抑制，所述免疫调节紊乱包括，例如，风湿性类型的疾病。与CD44反应的单克隆抗体，其抑制T细胞增殖，也被提供用于治疗各种自身免疫病。连接至含有外显子v6肽的CD44形式的单克隆抗体也被报道为适用于诊断炎症性疾病(Jalkanen et al.,1986)。WO91/17248涉及抗-CD44V抗体在治疗和诊断肿瘤中的应用。WO95/00851涉及直接针对CD44的可变的外显子的抗体在诊断肿瘤中的应用。WO95/04547公开了出于免疫治疗和免疫成像的目的的特别直接针对外显子v5序列内的表位的抗-CD44抗体的应用。直接针对外显子v6的一种抗-CD44抗体被WO 95/33771所公开。进一步地，EP0538754教导了直接针对CD44变体的抗体在免疫抑制方面的应用。现有技术所述的抗-CD44抗体显示出多个缺点。它们代表了庞大而复杂的分子，这些分子不得不通过重组生产方法而被制备。因此，所述生产方法过于复杂、代价高昂且不得不严格履行监管要求。进一步地，降低免疫原性的潜力的必要性需要人类抗体或人源化抗体的产生。因此，仍然需要CD44变体结合分子。因而本专利技术的目的是提供一种CD44变体结合物质，其克服了上述缺点中的至少一种。该问题通过依据权利要求1所述的一种CD44变体结合蛋白质的提供，并通过所述结合蛋白质在诊断和治疗中的应用，特别是通过涂覆有所述蛋白质的纳米颗粒的使用，得以解决。本专利技术所述的特定实施例为进一步的独立权利要求或从属权利要求的主题。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种结合至由人类CD44基因的外显子9(CD44ex9)编码的多肽的蛋白质，所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成：a)根据SEQ ID NO：ID NO：1-5所示的氨基酸序列；或b)与SEQ ID NO：ID NO：1-5所给出的氨基酸序列具有至少80％一致性的，优选85％一致性的，更优选90％一致性的，且最优选95％一致性的氨基酸序列；或c)与由以下序列所限定的CD44结合基序具有至少90％一致性的，优选至少95％一致性的或100％一致性的氨基酸序列：\PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE\，如SEQ ID NO：ID NO：6-10所示，其中，X表示任意的氨基酸；并且其中所述的蛋白质具有100个氨基酸或更小的长度。通过实施酵母双杂交筛选，专利技术人能够借助于特异性结合到被CD44的外显子9编码的多肽来识别五种不同的肽。所述氨基酸序列如图3和下表中所示，并且指定为SEQ ID NO：ID NO：1-5。一个进一步的分析表明，一个共有序列可源自具有以下氨基酸序列的这些序列：PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE。这些共有序列被指定为SEQ ID NO：6-10，如下表所示，由此这五个序列在任意序列X10-14的长度上不同；请注意，“X”被定义为任意氨基酸。衍生出唯一的共有序列的能力进一步验证了双杂交筛选方法的结果，其中所述的共有序列包括所有独立分离的CD44相互作用多肽。在随后的两个独立的亲和力检测中，SEQ ID NO：1-5的多肽被分析用于向被CD44的外显子9编码的多肽结合，并允许一个多肽亲和力的排名，由此多肽命名如下：序列号1的肽：肽A序列号2的肽：肽C序列号3的肽：肽B序列号4的肽：肽D序列号5的肽：肽E这两种亲和力检测，即伪样品挑选检测与基于荧光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)的检测揭示了同样的排名顺序：B>A,C,D,EC>A,D,ED>A,EE>AA>总之，肽B(＝序列号3的多肽)对CD44的外显子9编码的多肽具有最高的亲和力并且应当被视为本专利技术中优选的肽。为了此肽而实施表位定位，由此实施了缺失分析和丙氨酸扫描。此外，肽A，C，D和E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合至被人类CD44基因外显子9(CD44ex9)所编码的多肽的蛋白质，所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成：(i)根据SEQ ID NO：1‑5和SEQ ID NO：39‑52所示的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：1‑5和SEQ ID NO：39‑52所给出的氨基酸序列具有至少80％一致性的，优选85％一致性的，更优选90％一致性的，且最优选95％一致性的氨基酸序列；或(iii)与由以下序列所限定的CD44结合模体具有至少90％一致性的，优选至少95％一致性的或100％一致性的氨基酸序列：如SEQ ID NO：6‑10所示的PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10‑14AIE，或者由如SEQ ID NO：53‑62所示的PGLQPSFAVQVX2S/AXQX10‑14AIE所定义的序列，其中，X表示任意的氨基酸；并且其中所述的蛋白质具有100个氨基酸或更小的长度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.23 EP 13199325.51.一种结合至被人类CD44基因外显子9(CD44ex9)所编码的多肽的蛋白质，所述蛋白质包含以下物质或者由以下物质组成：(i)根据SEQ ID NO：1-5和SEQ ID NO：39-52所示的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：1-5和SEQ ID NO：39-52所给出的氨基酸序列具有至少80％一致性的，优选85％一致性的，更优选90％一致性的，且最优选95％一致性的氨基酸序列；或(iii)与由以下序列所限定的CD44结合模体具有至少90％一致性的，优选至少95％一致性的或100％一致性的氨基酸序列：如SEQ ID NO：6-10所示的\PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX10-14AIE\，或者由如SEQ ID NO：53-62所示的\PGLQPSFAVQVX2S/AXQX10-14AIE\所定义的序列，其中，X表示任意的氨基酸；并且其中所述的蛋白质具有100个氨基酸或更小的长度。2.根据权利要求1所述的CD44ex9结合蛋白质，其特征在于，其结合至一种CD44亚型，所述CD44亚型包含外显子9所编码的区域。3.根据权利要求2所述的CD44ex9结合蛋白质，其特征在于，所述CD44亚型选自以下名单，该名单包括：a)CD44v5,b)CD44v5-v6,c)CD44v3-v6,d)CD44v3-v6,e)CD44v2-v10,f)CD44v3-v10,g)CD44v4-v7,h)CD44v4-v10。4.根据权利要求1-3所述的CD44ex9结合蛋白质，其特征在于，其被偶联或融合至异源蛋白质或多肽，所述异源蛋白质或多肽优选为一种酶，所述酶从前体分子催化细胞毒素剂或细胞抑制剂的产生或催化标记粘附至所述蛋白质。5.一种偶联物，包含：a)根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质；b)一种化合物，选自以下物质所构成的组：碳水化合物，染料分子，放射性同位素，毒素，细胞抑制剂，细胞因子，免疫调节剂，或它们的前药；其中，所述化合物直接连接至所述CD44ex9结合蛋白质或者通过连接分子连接至所述CD44ex9结合蛋白质。6.一种分离的核酸分子，用于编码根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质。7.一种表达载体，其包含有根据权利要求6所述的核苷酸序列。8.一种宿主细胞，其包含有根据权利要求7所述的表达载体。9.一种生产根据权利要求1-4所述的CD44ex9结合蛋白质的方法，所述方法包括：a)采用表达构建来转化宿主细胞，所述表达构建包含编码权利要求1-4所述蛋白质的核酸分子；并且b)在适于生产所述CD44ex9结合蛋白质或各种融合蛋白质的条件下培养所述宿主细胞。10.一种纳米颗粒，其特征在于，其偶联至根据权利要求1-3所述的CD44ex9结合蛋白质。11.一种纳米颗粒，其特征在于，其偶联至根据权利要求4或5所述的偶联物或融合蛋白质。12.根据权利要求10或11所...

【专利技术属性】
技术研发人员：克劳迪娅·阿恩茨，沃尔夫冈·格雷布，
申请(专利权)人：交换成像技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE