自发组织用细胞集合体的制作方法技术

本发明专利技术发现对于在体外从大量的细胞(数万～数百万个)制作细胞集合体必要的要件，同时提供能实现肝脏或肾脏等的复杂的高级结构或与其他器官的相互作用的自发组织用细胞集合体的形成方法。在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养总细胞数40万个以上的任意的种类的细胞及/或组织和10万～40万个的间质细胞的混合物，使大小1mm以上的细胞集合体形成。由上述方法制作的细胞集合体。三维组织结构的制作方法，其包括使由上述方法制作的细胞集合体自发组织，使附加高级结构的三维组织结构形成。培养的侧截面是U或V字的形状的凝胶状培养支持体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及自发组织用细胞集合体的制作方法，更具体而言，涉及对于诱导向作为目的的组织－器官的自发组织必要的细胞集合体的制作方法。
技术介绍
近年，作为形成有复杂的结构的组织－器官的方法，利用细胞原本有的自发组织能力(Self-Organization)的方法受到关注(非专利文献1,2)。自发组织是指，1种或少数的种类的要素无需从外部受成为特别的“指示”的信息，发挥自身内在的特性而组织复杂的高级结构。例如，如雪的结晶形成等一样，观察到在无模式的集合体之中，产生自发的秩序而形成模式的自然现象，在纳米技术或光学结晶的制作等的工程学中也利用。作为用于诱导自发组织的要件，由高密度环境形成由均一的细胞组成的集合体(Aggregate)变得必要。从进行培养的ES·iPS细胞制成集合体制作脑、眼杯、垂体、齿等有被报告(非专利文献3-6)。作为这样的用于制作集合体的方法，通过使用底面具有U或V状的结构的如96孔等一样用于在底面集合的基材，主要使用从少数的细胞(数千个程度)的细胞集合体形成数百μm水平的组织的方法。但是，难以达成自多数的细胞(数万～数百万个)形成大型(200μm以上～)的细胞集合体。因此，制作由各种各样的种类的细胞组成的集合体难以适应以往的方法。从而，与小鼠等的小型动物的组织－器官比较，期望制作用于利用自发组织制作如人等一样大型的复杂的组织－器官的集合体的方法的开发。【现有技术文献】【非专利文献】非专利文献1：Camazine，S.，Deneubourg，J.-L.，Franks，N.R.，Sneyd，J.，Theraulaz，G.&Bonabeau，E.Self-Organization in Biological Systems(Princeton Univ.Press，2001)。非专利文献2：Takeichi，M.Self-organization of animal tissues：cadherin-mediated processes.Dev.Cell 21，24-26(2011).)非专利文献3：Eiraku，E.et al.Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.Nature 472，51-56(2011)。非专利文献4：Eiraku，M.et al.Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.Cell Stem Cell 3，519-532(2008)。非专利文献5：Suga，H.et al.Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture.Nature 480，57-62(2011)。非专利文献6：Sato，T.et al.Single Lgr5stem cells build crypt-villus structures体外without a mesenchymal niche.Nature 459，262-265(2009)。
技术实现思路
【专利技术要解决的技术课题】专利技术人通过活用3种不同的细胞谱系的时空间的相互作用，确立使“基于器官的再构成的器官细胞的分化诱导”实现化的革新的的三维培养技术。即，通过使对于器官发生的初期过程必须的器官细胞和血管细胞和间质细胞的细胞间相互作用再现化诱导更立体的器官的原基(器官的种)，确立使有血管网的功能性的器官的创造成为可能的基盘技术(Nature,499(7459)，481-484、PCT/JP2012/074840：组织及器官的制作方法)。一方面，为了对肾脏或肝脏－肺脏等的疾病的药品开发或再生医疗的实现，不仅血管结构，例如，如尿管结构或胆管结构、气管结构等一样，必须再现附加进一步的高级结构的3维的复杂的结构或细胞极性。进一步说，通过经与其他器官的相互作用达成目的器官的诱导。从而，为了使自多能性干细胞诱导的组织或自个体分离的组织的功能最大化，有必要使多样的高级结构或与其他器官的连续性的再构建成为可能的三维组织体的形成。但是，在以往考案的方法中，仅从3种细胞或组织制作仅有血管结构的组织体，未提及用于制作更复杂的高级结构(尿管结构或胆管结构、气管结构)的方法。在本专利技术中旨在发现对于在体外从多个细胞(数万～数百万个)制作细胞集合体的必要的要件，同时提供肝脏或肾脏等的复杂的高级结构或能实现与其他器官的相互作用的自发组织用细胞集合体的形成方法。【解决课题的技术方案】本专利技术人由下述1～4的操作，成功从单离的多种细胞或组织制作有复杂的高级结构的三维组织－器官，从而完成本专利技术。【1.必要的细胞－组织的调制】(A)调制对于向有复杂的结构的组织的自发组织必要的任意的种类的细胞或组织。不限种类或组合数。(B)相对于总细胞数200万个左右的，由任意的种类的细胞或组织组成的混合液，混合10～40万个左右单离的间质细胞。【2.支持体的制作】(A)在细胞培养用的培养皿上形成适当的硬度的支持体，固层化。此时，作为支持体的材料，优选使用水凝胶(聚丙烯酰胺凝胶等)，但不限于此。(B)在制作的支持体上实施化学－物理修饰。此时，向支持体的修饰的赋予是不必须的要件。作为化学因子，优选使用基质胶或层粘连蛋白，但不限于此。(C)还有，根据作为目的的集合体的形－尺寸－量，支持体的硬度没必要均一，通过为硬度设定空间的－时间的梯度或模式化，能在之后的实验中使用。【3.细胞集合体的制作－培养】将1.中制作的细胞－组织的混合液在2.中制作的支持体上接种，形成集合体。形成的集合体通过延长培养期间，能在试管内作为目的的器官的自发组织中使用。还有，通过将使细胞在底面集合的培养基材和间质细胞组合，自少数的细胞即可制作集合体。【4.细胞集合体的移植】通过将3.中制作的集合体长期培养或向活体内移植，诱导血液灌流，通过向有复杂的结构的高级组织的自发组织，制作有与成体组织同等的高度成秩序的组织结构的组织－器官变得可能。通过这样将间质细胞和支持体的物理－化学特性组合，制作由任意的种类的细胞组成的复杂的细胞集合体的方法在过去不存在，被认为是新颖性的极高的方法。本专利技术的要点如下。(1)在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。(2)(1)所述的方法，其中细胞集合体可由自发组织形成附加高级结构的三维组织结构。(3)(1)或(2)所述的方法，其中将任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物在间质细胞能收缩的凝胶状支持体上培养。(4)(3)所述的方法，其中培养是二维培养。(5)(3)或(4)所述的方法，其中凝胶状支持体是平面，或者凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状。(6)(3)～(5)之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的中心部的硬度比周边部的硬度硬。(7)(3)～(5)之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的周边部的硬度比中心部的硬度硬。(8)(3)～本文档来自技高网...

【技术保护点】
在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.27 JP 2014-0373411.在体外制作细胞集合体的方法，其包括培养任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物，使细胞集合体形成。2.权利要求1所述的方法，其中细胞集合体可由自发组织形成附加高级结构的三维组织结构。3.权利要求1或2所述的方法，其中将任意的种类的细胞及/或组织和间质细胞的混合物在间质细胞能收缩的凝胶状支持体上培养。4.权利要求3所述的方法，其中培养是二维培养。5.权利要求3或4所述的方法，其中凝胶状支持体是平面，或者凝胶状支持体的培养的侧截面是U或V字的形状。6.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的中心部的硬度比周边部的硬度硬。7.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体的周边部的硬度比中心部的硬度硬。8.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体经模式化，有1个以上中心部的硬度比周边部的硬度硬的模式。9.权利要求3～5之任一项所述的方法，其中凝胶状支持体经模式化，有1个以上周边部的硬度比中心部的硬度硬的模式。10.权利要求1～9之任一项所述的方法，其中任意的种类的细胞及/或组织是总细胞数40万个以上，间质细胞是10万～40万个。11.权利要求1～10之任一项所述的方法，其中细胞集合体的大小是1mm以上。12.权利要求1～11之任一项所述的方法，其中细胞集合体的形成是自...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，谷口英树，吉川洋史，
申请(专利权)人：公立大学法人横滨市立大学，国立大学法人埼玉大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP