本发明专利技术涉及一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，属于色氨酸的检测技术领域。本发明专利技术的检测方法通过特定的样品前处理、HPLC分析准备和色氨酸检测标准曲线的绘制，具有较高的灵敏度和精确度，检测限低，重现性较好，快速，定性和定量准确且回收率较高，能够准确分析饲料中的色氨酸，可用于大规模样品检测，适于标准化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种饲料中氨基酸的检测方法，更具体地说，本专利技术涉及一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，属于色氨酸的检测
技术介绍
色氨酸通常以游离或结合态广泛存在于生物体中，是人类和动物必需的8种氨基酸之一，其作为一种功能性的氨基酸，在动物体组成、摄食、免疫、抗应激等方面发挥着重要的作用。在对畜禽动物的研究中发现，低蛋白质饲料中添加色氨酸，可以提高动物的摄食量、生长性能，促进营养物质的消化吸收，可获得与高蛋白质饲料相似的生长性能。色氨酸对生物的生长和氮平衡非常重要，可参与动物体内血浆蛋白质的更新，可促使核黄素发挥作用，还有助于烟酸及血红素的合成，可显著增加怀孕动物胎仔体内抗体，对泌乳期的乳牛和母猪有促进泌乳作用。色氨酸缺乏会引起一系列疾病，当畜禽缺乏色氨酸时，生长停滞，体重下降，脂肪积累降低。而动物体本身不能合成色氨酸，因此饲料中色氨酸的平衡和补充就显得十分重要。现行国家标准GB/T 15400-1994《饲料中色氨酸测定方法 分光光度法》，分光光度法易受颜色较深或某些复杂组分的干扰，而随着高效液相色谱仪的普及，液相色谱法越来越多被应用于准确定量。2000年颁布的国家标准GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》附录A中，将色氨酸的测定方法改为高效液相色谱法。然而，该标准使用的流动相是甲醇和乙酸钠缓冲液（调节pH=4.0），其主要的弊端有以下两个：一是出峰较慢，分析时间长；二是色氨酸在220 nm和280 nm波长下有较强吸收，220 nm比280 nm的响应高6倍，而乙酸钠和甲醇在220 nm处有吸收，会干扰样品测定，所以检测波长一般都选用280 nm，对于低含量样品，检测灵敏度不高。同时，样品前处理方法费时、耗力，水解过程不易控制，如中途停电，烘箱温度控制失效等均给水解过程带来麻烦。随着国内外仪器配置水平的不断提高，价格适中、准确度较高的高效液相色谱方法日益受到重视。因此，建立一种可靠的饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，可为饲料配方调整提供理论依据，对于指导饲料企业生产、加强饲料产品控制具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有高效液相色谱法测定饲料中色氨酸的方法出峰较慢，分析时间长，测定会受到干扰，检测灵敏度不高的问题，提供一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，具有较高的灵敏度和精确度，重现性较好，快速，定性和定量准确且回收率较高，能够准确分析饲料中的色氨酸。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：A、样品前处理将饲料样品粉碎，放入微波辅助蛋白质水解设备中进行微波辅助蛋白质水解；其中控制微波功率为600-1000 W，控制温度为在10-30 min内从常温升至150-170 ℃，然后保温20-40 min；保温结束后，将水解液进行处理，待高效液相色谱检测；B、HPLC分析准备色谱柱：Syncronis C18色谱柱，250×4.6 mm，5 µm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测器：DAD检测器，检测波长：220 nm；流动相：等度洗脱，0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液+乙腈＝90+10（V+V）；C、色氨酸检测标准曲线的绘制准备色氨酸标准品，采用步骤B的条件进行测定，绘制标准曲线。上述步骤为本专利技术的基本技术方案。取不同的实际样品，根据步骤A样品前处理后（水解后的水解液处理为常规处理即可），按步骤B中检测条件进行检测，并利用步骤C中得到的标准曲线计算样品中色氨酸的含量。本专利技术在步骤A中，所述的样品前处理具体为：将饲料样品粉碎，准确称取样品19-21 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氢氧化钠溶液0.5-1 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐内加入5 mol/L氢氧化钠溶液120-150 mL，将水解槽放入微波水解罐，再将微波水解罐放入密封装置中，拧紧，插入温度传感器，抽真空，充入高纯氮气以保护样品，重复3次，在600-1000 W功率条件下，在10-30 min内从常温升至150-170 ℃，然后保温20-40 min，保温结束后，当温度冷却至常温，打开密封装置，取出水解槽，将聚四氟乙烯管逐一取下后，将水解液全部转移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的盐酸溶液调至中性，超纯水定容至25 mL；摇匀后，10000 r/min离心10 min，过0.22 µm滤膜，待高效液相色谱检测。本专利技术在步骤A中，所述准确称取样品19-21 mg精确至0.01 mg。本专利技术在步骤C中，所述的色氨酸检测标准曲线的绘制具体为：准确称取适量色氨酸标准品各10.0 mg（纯度≥99.5%），用适量水和数滴0.1 mol/L的氢氧化钠溶解，并用水定容至50 mL；分别准确吸取适量色氨酸标准溶液储备液，用水配制成浓度分别为0.2 µg/mL，2.0 µg/mL，4.0 µg/mL，20.0 µg/mL，40.0 µg/mL的色氨酸标准工作液，供上机使用；采用步骤B的条件进行测定，以峰面积Y对浓度X(μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，通过不断降低标准溶液浓度，取信噪比为3时的浓度为检出限，检出限为0.02 µg/mL。本专利技术带来的有益技术效果：1、本专利技术解决了现有高效液相色谱法测定饲料中色氨酸的方法出峰较慢，分析时间长，测定会受到干扰，检测灵敏度不高的问题，提供了一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法。该方法具有较高的灵敏度和精确度，检测限低，重现性较好，快速，定性和定量准确且回收率较高，能够准确分析饲料中的色氨酸，可用于大规模样品检测，适于标准化。2、本专利技术采用特定的乙腈-磷酸二氢钾溶液作为流动相，结合特定的检测条件，分离情况大为改观，并且可以大大降低流动相的背景干扰，对低含量样品有较高的灵敏度。另外能够选用220nm作为检测波长，降低了色氨酸的检出限。3、本专利技术采用微波辅助蛋白质水解设备，结合特定的水解工艺参数，易于控制水解条件，重现性好，大大缩短了分析时间，提高了检测效率，能够适用于大规模样品的快速检测。附图说明图1为色氨酸标准品溶液色谱图；图2为色氨酸的标准曲线，横坐标为色氨酸浓度，纵坐标为色氨酸色谱峰峰面积。具体实施方式实施例1一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：A、样品前处理将饲料样品粉碎，放入微波辅助蛋白质水解设备中进行微波辅助蛋白质水解；其中控制微波功率为600 W，控制温度为在10 min内从常温升至150 ℃，然后保温20 min；保温结束后，将水解液进行处理，待高效液相色谱检测；B、HPLC分析准备色谱柱：Syncronis C18色谱柱，250×4.6 mm，5 µm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测器：DAD检测器，检测波长：220 nm；流动相：等度洗脱，0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液+乙腈＝90+10（V+V）；C、色氨酸检测标准曲线的绘制准备色氨酸标准品，采用步骤B的条件进行测定，绘制标准曲线。实施例2一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：A、样品前处理将饲料样品粉碎，放入微波辅助蛋白质水解设备中进行微波辅助蛋白质水解；其中控制微波功率为1000 W，控制温度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：A、样品前处理将饲料样品粉碎，放入微波辅助蛋白质水解设备中进行微波辅助蛋白质水解；其中控制微波功率为600‑100 0W，控制温度为在10‑30 min内从常温升至150‑170 ℃，然后保温20‑40 min；保温结束后，将水解液进行处理，待高效液相色谱检测；B、HPLC分析准备色谱柱：Syncronis C18色谱柱，250×4.6 mm，5 µm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测器：DAD检测器，检测波长：220 nm；流动相：等度洗脱，0.0 mol/L磷酸二氢钾溶液+乙腈＝90+10（V+V）；C、色氨酸检测标准曲线的绘制准备色氨酸标准品，采用步骤B的条件进行测定，绘制标准曲线。
【技术特征摘要】
1.一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：A、样品前处理将饲料样品粉碎，放入微波辅助蛋白质水解设备中进行微波辅助蛋白质水解；其中控制微波功率为600-100 0W，控制温度为在10-30 min内从常温升至150-170 ℃，然后保温20-40 min；保温结束后，将水解液进行处理，待高效液相色谱检测；B、HPLC分析准备色谱柱：Syncronis C18色谱柱，250×4.6 mm，5 µm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测器：DAD检测器，检测波长：220 nm；流动相：等度洗脱，0.0 mol/L磷酸二氢钾溶液+乙腈＝90+10（V+V）；C、色氨酸检测标准曲线的绘制准备色氨酸标准品，采用步骤B的条件进行测定，绘制标准曲线。2.根据权利要求1所述的一种饲料中色氨酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于：在步骤A中，所述的样品前处理具体为：将饲料样品粉碎，准确称取样品19-21 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氢氧化钠溶液0.5-1 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐内加入5 mol/L氢氧化钠溶液120-150 mL，将水解槽放入微波水解罐，再将微波水解罐放入密封装置中，拧紧，插入温度传感器，抽真空，充入高纯氮气以保护样品，重复3次，在600-100...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵艳，杨发树，宋军，张艳红，张凤枰，刘耀敏，
申请(专利权)人：四川威尔检测技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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