【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】1 介绍本文描述将核酸序列插入宿主细胞的方法。本文还描述包含插入核酸序列的遗传稳定的宿主细胞和将这样的宿主细胞用于产生蛋白的方法，以及这样的宿主细胞用于糖基化蛋白的用途。2 背景单一基因或小DNA片段的重组表达最经常通过在质粒上提供重组基因来进行。质粒可以通过分子生物学技术有效地产生和操作[1]。将它们快速插入宿主细胞中并通过也在环状质粒分子上编码的抗性盒赋予具有质粒的宿主细胞的抗生素选择来维持。通常，重组蛋白使用含有编码该蛋白的基因的质粒来表达。大DNA片段的重组表达具有各种限制。例如标准表达质粒在插入大DNA片段之后经常是遗传不稳定的。经常，使用粘粒(cosmids)和/或F粘粒(fosmids)，其含有通过几种机制稳定化插入的DNA的元件，以试图克服质粒不稳定性。进一步，质粒的拷贝数经不同数量级范围，这取决于复制起始点，并且它们可以额外受到生长状态[2]、培养基组成和个体细胞与细胞的差异[3]的影响。此外，仅有有限数量的粘粒和F粘粒可用。因此，通常难于在单一细胞中组合多个大DNA片段。质粒的额外缺点通常是需要选择压力来维持细胞中的附加型元件，无论它们是大质粒或小质粒。选择压力需要使用抗生素，这对于医学产品的生产是不期望的，这是由于针对抗生素的过敏反应的危险以及用于制造的额外成本。此外，选择压力经常不完全，导致产生不均一的细菌培养物，其中一些克隆已丢失质粒，并因此不再产生重组产物[4]。进一步，大DNA片段染色体在宿主细胞中插入是困难的。尽管已使用多种策略来将大DNA片段插入大肠杆菌基因组中[5]，但目前已有方法不允许将大于8 kb的DNA片段在期望的位...
【技术保护点】
宿主细胞，其含有供体质粒和辅助质粒，(a)其中所述辅助质粒含有：(i)在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放阅读框；和(ii)在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放阅读框，所述限制性内切核酸酶具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列；以及(b)其中所述供体质粒含有：(i)从5'至3'：(1)所述限制性内切核酸酶的识别序列，(2)至少0.5千碱基(kb)的第一同源区，(3)至少8 kb的异源插入DNA；和(4)至少0.5 kb的第二同源区；以及(ii)反选择标记物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.11 US 61/8896721.宿主细胞，其含有供体质粒和辅助质粒，(a)其中所述辅助质粒含有：(i)在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放阅读框；和(ii)在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放阅读框，所述限制性内切核酸酶具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列；以及(b)其中所述供体质粒含有：(i)从5'至3'：(1)所述限制性内切核酸酶的识别序列，(2)至少0.5千碱基(kb)的第一同源区，(3)至少8 kb的异源插入DNA；和(4)至少0.5 kb的第二同源区；以及(ii)反选择标记物。2.权利要求1的宿主细胞，其中所述异源插入DNA含有选择标记物。3.权利要求2的宿主细胞，其中所述选择标记物侧接翻转酶识别目标(FRT)位点。4.权利要求1-3中任一项的宿主细胞，其中所述第一和第二同源区是与所述宿主细胞基因组的相邻区域同源的。5.权利要求1-4中任一项的宿主细胞，其中所述第一同源区为至少2 kb。6.权利要求1-5中任一项的宿主细胞，其中所述第二同源区为至少2 kb。7.权利要求1-6中任一项的宿主细胞，其中所述异源插入DNA为至少20 kb。8.权利要求1-7中任一项的宿主细胞，其中所述识别序列含有至少18个碱基对。9.权利要求1的宿主细胞，其中所述限制性内切核酸酶为SceI。10.权利要求1的宿主细胞，其中所述反选择标记物为sacB。11.权利要求1-10中任一项的宿主细胞，所述宿主细胞进一步含有寡糖基转移酶。12.权利要求11的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶是与所述宿主细胞异源的。13.权利要求11或12的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶是原核寡糖基转移酶。14.权利要求1-13中任一项的宿主细胞，所述宿主细胞进一步含有至少一种糖基转移酶。15.权利要求14的宿主细胞，其中所述糖基转移酶是与所述宿主细胞异源的。16.权利要求15的宿主细胞，其中所述异源糖基转移酶是原核糖基转移酶。17.权利要求1-16中任一项的宿主细胞，其中对于所述宿主细胞天然的一种或多种基因已被缺失或失活。18.权利要求1-17中任一项的宿主细胞，其中所述异源插入DNA含有原核生物的rfb簇。19.权利要求18的宿主细胞，其中所述rfb簇为大肠杆菌rfb簇、假单胞菌(Pseudomonas) rfb簇、沙门氏菌(Salmonella) rfb簇、耶尔森氏菌(Yersinia) rfb簇、弗朗西斯氏菌(Francisella) rfb簇、克雷伯氏菌(Klebsiella) rfb簇、来自鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)菌株的rfb簇、志贺氏菌(Shigella) rfb簇、或者伯克霍尔德氏菌(Burkholderia) rfb簇。20.权利要求19的宿主细胞，其中所述rfb簇为大肠杆菌rfb簇。21.权利要求20的宿主细胞，其中所述大肠杆菌rfb簇为血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186或O187。22.权利要求1-17中任一项的宿主细胞，其中所述异源插入DNA含有原核生物的荚膜多糖基因簇。23.权利要求22的宿主细胞，其中所述多糖基因簇来自大肠杆菌菌株、链球菌菌株、葡萄球菌菌株、或者伯克霍尔德氏菌菌株。24.权利要求1-17中任一项的宿主细胞，其中所述异源插入DNA编码大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、不动杆菌、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、李斯特氏菌(Listeria)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、副百日咳博得特氏菌(Bordetella parapertussis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)和类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、或弯曲菌(Campylobacter)的O抗原。25.权利要求24的宿主细胞，其中所述大肠杆菌的O抗原为O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186或O187。26.权利要求24的宿主细胞，其中所述克雷伯氏菌的O抗原为肺炎克雷伯氏菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、或O12。27.权利要求1-17中任一项的宿主细胞，其中所述异源插入DNA编码伯氏疏螺旋体糖脂、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白O聚糖或脂寡糖(LOS)、流感嗜血杆菌LOS、硕大利什曼原虫脂磷聚糖、或者肿瘤相关的碳水化合物抗原。28.权利要求1-27中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步含有编码载体蛋白的核酸，所述载体蛋白含有用于N-糖基化的共有序列。29.权利要求28的宿主细胞，其中所述编码载体蛋白的核酸是与所述宿主细胞异源的。30.权利要求28或29的宿主细胞，其中所述载体蛋白为脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的信使结构域、空肠弯曲菌AcrA、或者空肠弯曲菌的天然糖蛋白。31.权利要求30的宿主细胞，其中所述载体蛋白为脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)。32.权利要求1-31中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为埃希氏菌种、志贺氏菌种、克雷伯氏菌种、黄单胞菌(Xhantomonas)种、沙门氏菌种、耶尔森氏菌种、乳球菌种、乳杆菌种、假单胞菌种、棒杆菌(Corynebacterium)种、链霉菌种、链球菌种、葡萄球菌种、芽孢杆菌种、或者梭状芽胞杆菌(Clostridium)种。33.权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌种。34.产生含有载体蛋白和抗原的糖缀合物的方法，其中所述方法包括在适于蛋白产生的条件下培养权利要求28-33中任一项的宿主细胞。35.由权利要求34的方法产生的糖缀合物。36.权利要求35的糖缀合物，其中所述糖缀合物含有载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：M瓦克，M科瓦里克，F弗南德茨，
申请(专利权)人：格林考瓦因有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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