本发明专利技术涉及包含与SEQ ID NO:1至少80%相同的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成的分离的P450酶，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸突变。本发明专利技术还涉及包含编码所述酶的序列的分离的核酸，包含所述核酸的载体，和含有所述核酸或所述载体的宿主细胞。还提供了用于制备所述酶的方法和使用在本发明专利技术中表征的酶或宿主细胞产生类固醇激素前体的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及具有增加的酶活性的细胞色素P450单加氧酶。哺乳动物线粒体P450构成细胞色素的一个小家族，其在线粒体内执行特定的反应并在大量疏水化合物的代谢中发挥重要作用。例如，P450c11beta和P450c11AS(由CYP11B1和CYP11B2基因编码)分别执行糖皮质激素和盐皮质激素生物合成的最后一步。P450c11beta是一个经典的类固醇11β羟化酶，其将11脱氧皮质醇转变成氢化可的松，而P450c11AS通过三个连续的步骤催化脱氧皮质酮转变成醛固酮。CYP27A1是线粒体内P450的另一个例子，其是固醇27-羟化酶和维生素D25羟化酶。最后，最具代表性的线粒体P450是P450scc(侧链切割酶)，由CYP11A1基因编码，其切割胆固醇侧链，从而通过两个连续的羟基化和最终的切割将胆固醇转变成孕烯醇酮。P450scc通过将固醇转变成类固醇，执行类固醇生物合成的第一个关键步骤。P450催化大量底物的区域、化学和立体特异性氧化的能力，反映了它们的生物学作用，使它们成为生物技术应用中的重要候选物。特别地，类固醇激素被广泛用作抗炎、避孕和抗增殖药物。在哺乳动物中，这些类固醇的合成开始于胆固醇向孕烯醇酮转变的侧链切割反应。孕烯醇酮作为基础用于生产进一步的类固醇激素，例如氢化可的松，并且由于它可以从廉价的底物例如胆固醇及其植物来源类似物进行大规模工业转化，因此获得了极大的关注。然而，胆固醇成为孕烯醇酮的侧链切割反应是整个类固醇过程中的限制性步骤。在哺乳动物中，它是由膜结合的CYP11A1酶催化的。然而，由于多种原因，P450的生物技术和工业使用是难以实现的，并且不令人满意。线粒体P450使用由两种蛋白(即铁氧还蛋白还原酶(FdxR)和铁氧还蛋白(Fdx1)，也称为肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)和肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx))构成的特殊电子传递者链。在体内自然状态下，FdxR从NADPH获得电子，而Fdx1将电子从FdxR运送到线粒体P450。已经开发出了一种体外系统，其中FdxR处于催化浓度(0.5μM)而Fdx1处于饱和浓度(10μM)。为了使这种体外系统有效，电子必须适当地流向(fluxed)P450。为了尝试克服这些困难，一些作者使用可变的铰链或连接子序列融合了P450scc(或P450c11beta)、Fdx1和FdxR这三个肽。即使这种三重融合产生了有功能的蛋白质，但是其效力与“真实的(bona fide)”多肽相比要低，并且不能够工业规模使用。而且，线粒体环境难以在微生物重组系统中被模拟。例如，P450scc多肽能够被适当地靶定到酵母的线粒体。然而，由于线粒体中不存在底物和/或P450scc的不当折叠或靶定，所靶定的多肽不能够将固醇变成孕烯醇酮。不同的重组系统被用来从植物固醇产生生物合成的孕烯醇酮。例如，在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中开发了一种生物合成系统。在这个系统中，P450scc与FdxR和Fdx1一起被靶定在线粒体外部的质膜上，并且在该膜上遵循固醇途径来生产固醇。此外，P450c11beta可以和Fdx和FdxR1一起被靶定到线粒体上，在那里它可以将11-脱氧皮质醇转变成皮质醇。在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中开发出了一种生物转化系统。在这个系统中，胆固醇能够被成熟形式的P450scc、Fdx1和FdxR1转变成孕烯醇酮。生物合成仍然是工业规模下最有吸引力的技术，因为底物可以通过宿主作为可溶性分子从简单的碳源制造，从而避免了使用去污剂的负担。最近，人们已经做出努力以产生新的具有改进特征的P450scc多肽。例如，已经创制了携带K193E突变的重组P450scc突变体。这种突变体比重组的野生型多肽可溶性更好，因此较不容易聚集。因此，使用这种突变体可以获得更高的表达水平，而不会改变其酶特征。然而，仍然需要具有增加的酶活性的改进P450scc多肽，以允许优化类固醇激素的生产，特别是适合于工业化过程。本专利技术人开发了一种携带特定突变的新型P450scc多肽。这种突变体在将底物转变成类固醇激素的方面显示了出人意料的改善的酶活性。因此，本专利技术涉及一种新的分离的P450酶，其包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或者由该氨基酸序列构成，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。在一些实施方案中，该新型P450酶与SEQ ID NO:1至少85％、90％、95％、98％或99％相同。本专利技术还涉及一种分离的核酸，其包含编码所述酶的核苷酸序列或者由编码所述酶的核苷酸序列构成，并涉及包含与表达调控序列操作连接的所述核酸的载体，和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞，所述宿主细胞是例如微生物。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种遗传工程化的微生物，其能够将底物转变成类固醇激素前体。该底物可以是，例如具有脂肪族侧链的多环、不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物或胆固醇衍生物。该遗传工程化的微生物包含，例如，编码本专利技术表征的新型P450酶的核酸，和任选的编码肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)的核酸序列和/或编码肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)的核酸序列。在另一个方面中，本专利技术提供了一种用于制备本专利技术表征的P450酶的体外方法，所述方法包括如下步骤：a)在适合于获得P450酶表达的条件下培养宿主细胞；和b)回收所表达的酶。在另一个实施方案中，本专利技术表征的P450酶用于产生类固醇激素前体。本专利技术进一步涉及用于产生类固醇激素前体的方法，包括如下步骤：a)提供表达本专利技术所表征的P450酶的微生物，b)在允许该P450酶表达的条件下培养所述微生物，c)在允许微生物从所述底物产生类固醇激素前体的条件下，使在步骤b)获得的微生物培养物与选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和胆固醇衍生物，和d)回收所产生的类固醇激素前体。本专利技术还涉及用于产生类固醇激素前体的方法，例如体外方法，包括如下步骤：a)在允许所述底物被转变成类固醇激素前体的条件下，使本专利技术所表征的P450酶与分离的肾上腺皮质铁氧还蛋白(Adx)多肽、分离的肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)多肽和选自下组的底物接触：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类似物和衍生物，和b)回收所获得的类固醇激素前体。类固醇激素被广泛用作抗炎、避孕和抗增殖药物。本专利技术能够用于生产类固醇激素前体，并帮助合成用于人类的类固醇激素。类固醇激素前体，例如孕烯醇酮，作为基础用于生产进一步的类固醇激素，例如氢化可的松，并且由于它可以进行工业大规模转化，因此获得了极大的关注。专利技术详述酶“分离的”酶或多肽，其意指所述酶或多肽不再处原始表达它的生物体内的天然环境下。当涉及酶或多肽时，“纯化的”意思是所指分子在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的条件下存在。如本文所使用的，术语“纯化的”意思是存在按重量计至少75％的，按重量计至少85％的，按重量计至少95％的，或按重量计至少98％的相同类型的生物大分子。术语“细胞色素P450酶”或“P450酶”是指能够催化某些反应的单加氧酶，例如在下列文献本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的P450酶，其包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.20 EP 14305071.41.一种分离的P450酶，其包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列或由该氨基酸序列构成，其中所述序列包含在对应于位置225的位置处的苏氨酸和/或在对应于位置289的位置处的天冬氨酸。2.根据权利要求1的酶，其包含选自下组的序列或由选自下组的序列构成：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。3.根据权利要求1或2的酶，由序列SEQ ID NO:1构成。4.一种分离的核酸，其包含如下的核苷酸序列或者由如下的核苷酸序列构成，所述核苷酸序列编码如权利要求1-3中任一项所限定的酶。5.一种载体，其包含如权利要求4所限定的核酸，其与表达调控序列可操作地连接。6.根据权利要求5的载体，进一步包含编码肾上腺皮质铁氧还蛋白(adrenodoxin)(Adx)的核酸序列和/或编码肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxin reductase)(AdR)的核酸序列。7.一种宿主细胞，其包含如权利要求4所限定的核酸或者如权利要求5或6所限定的载体。8.根据权利要求7的宿主细胞，其是遗传工程化的微生物。9.根据权利要求7或8的宿主细胞，其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。10.一种遗传工程化的微生物，其能够将选自下组的底物转变成类固醇激素前体：具有脂肪族侧链的多环和不饱和一元醇，例如胆固醇、胆固醇类...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·伯廷，B·杜马斯，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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