核酸检测方法和试剂盒技术

提供了用于检测靶标核酸的方法和试剂盒，其中扩增的核酸与例如顺磁性珠的颗粒结合形成絮凝型复合物，所述絮凝型复合物可以通过视觉观察检测。可以被检测的核酸样本的体积低至几微升。该方法可以应用于实地或照护点诊断，用于快速确定靶标核酸的存在或不存在。还可以确定靶标核酸的甲基化状态。所述方法和试剂盒具有在植物和动物中检测疾病、环境检测以及食品和其它可食用产品污染检测的普遍适用性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸检测。更具体地，本专利技术涉及使用相对小体积的核酸样本快速检测核酸，其中通过视觉观察检测核酸。
技术介绍
高度需求在现场或照护点(point-of-care，POC)以最低限度的设备进行的、快速且低成本的核酸生物测定。虽然为实现这一目标进行了很多尝试，目前在实践中没有实现。已知用于检测疾病DNA生物标记物的技术和方法，包括聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)1。然而，这些方法需要在热循环仪上进行热循环以实现快速指数DNA扩增，且因此不适合用于实地(field)或现场应用。但是，最近已经出现多种用以克服这种限制的等温的DNA扩增方法2,3。例如，为实现POC应用，通过重组酶聚合酶扩增(RPA)4或依赖解旋酶扩增(HDA)5扩增的病原体DNA已被调整而用于在横向流条和便携式荧光针上进行检测6-9。然而，这种读取方法虽然方便，但仍然依赖于使用相对复杂的设备，以及可能对于全世界的操作者仍然存在资金障碍。此外，在实地进行采样，即使有的话，也极少被讨论。具体的，使用最少的人操作和现场设施始终产生固定量的样本DNA用于下游应用。这个重要问题对任何测定的性能具有显著的影响。因此，用于现场的核酸检测应用的实地即用(field-ready)综合测定仍然是难以实现的愿望。一个可以受益于低成本现场测定的领域是在农业中。农业产业是世界经济主要的贡献者(估计每年1.5万亿美元)。然而，农作物疾病爆发是在依赖农业的经济中的主要问题，特别是在发展中国家中，估计每年农作物损失2200亿美元10。目前，一旦疾病爆发传播超过某个阈值，则没有办法挽救受害的农作物。控制疾病爆发的理想的方法是通过在其传播之前在实地早期检测。农作物疾病管理的有效性高度依赖于诊断方法的快捷性、敏感性和特异性。传统上疾病鉴定是通过视觉检查受影响的植物组织的疾病表型而进行的。然而，这需要有经验的植物病理学家并且是相对主观的11。许多敏感的用以提高疾病鉴定诊断的方法，例如已经开发了酶联免疫吸附测定(ELISA)12,13、免疫印迹14,15、免疫荧光测试16和基于PCR测定的多种迭代(iterations)17,18用以促进疾病诊断。然而，所有这些检测方法需要昂贵且复杂的设备，并且仅能在实验室中通过训练有素的技术人员进行。此外，缺乏快速的现场检测导致部署疾病控制措施的延迟，反过来导致农作物进一步损失。因此，有必要开发新的可在实地的应用的疾病诊断技术，不需要使用专业的实验室设备。此外，这些技术应该是廉价的、敏感的、可重复的，并且不需要专业人员，其最终目标是允许每个农民检测他或她自己的农作物。相似地，早期检测农场动物病原体对避免疾病的传播是至关重要的，尤其是在使用密集生产方法的现代农场中。此外，早期诊断和检测人疾病，以及不依赖于复杂的技术需求的可用的POC方法，在发达以及发展中国家中，特别是在自然灾害情况(例如台风、海啸或地震)后，可以挽救无数生命。
技术实现思路
专利技术人意识到对简单的、可靠的、快速的和廉价的核酸检测方法的需求。因此，本专利技术广泛的提供了一种用于以相对小的样本大小快速检测核酸的方法和试剂盒，其中核酸的存在和/或不存在可以通过视觉检测到。本方法的优势在于，以优选的形式，其排除了对设备的需求，例如离心机、热循环仪和分光光度计，所有这些需要利用主电力(main electricity)或电池形式的能。在具体的实施方案中，所述方法或试剂盒可以用于检测植物、人和非人动物的一种或多种非致病性或致病性生物。在第一方面，本专利技术提供了一种检测核酸的方法，所述方法包括使分离的核酸与颗粒结合的步骤，其中所述分离的核酸与所述颗粒能够形成可以通过视觉观察而被检测的复合物。合适地，与在没有或相对低的量或浓度的核酸中观察到的相比，通过存在或相对增加水平的可视觉检测的复合物指示核酸的存在或相对量。在一个实施方案中，所述颗粒是顺磁性颗粒。在一个优选的实施方案中，所述颗粒是SPRI颗粒。优选地，所述颗粒在pH<7中与分离的核酸形成复合物。在一个优选的实施方案中，pH在约3.6-5.5的范围，或者更优选地约pH 4.4。根据本实施方案，通过核酸-颗粒复合物的絮凝形成复合物。在另一个实施方案中，所述方法可以包括使用着色剂以促进、帮助或提高核酸-颗粒复合物的视觉检测。合适地，所述着色剂结合核酸，并且提供在视觉范围的波长(即约390nm至约700nm)的光学特征(signature)。光学特征可以包括在视觉范围内的波长的光(包括磷光和/或荧光)的吸收或发射。合适地，分离的核酸是通过在核酸样本中存在的模板核酸的核酸序列扩增获得的。典型地，模板核酸的核酸序列扩增包括一种或多种引物，其至少部分特异于模板核酸。在优选的形式中，通过等温核酸序列扩增获得分离的核酸。在一个实施方案中，等温核酸序列扩增是重组酶聚合酶扩增(RPA)。在另一个实施方案中，等温核酸序列扩增是滚环扩增(RCA)。合适地，模板核酸存在于核酸样本，所述核酸样本可从任何生物或其他来源的核酸获得。在优选的形式中，模板核酸通过以下一个或多个步骤获得，包括：(a)包含靶标核酸的核酸样本的重力过滤；(b)使靶标核酸与颗粒结合；和(c)从颗粒洗脱靶标核酸。在典型实施方案中，在步骤(b)和/或步骤(c)中靶标核酸的体积是约10μL。在另一方面，本专利技术提供了一种用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包含能够与分离的核酸形成复合物的颗粒，所述复合物能够通过视觉观察检测。所述试剂盒可进一步包含以下的一种或多种：用于核酸序列扩增的核酸聚合酶；一种或多种用于核酸序列扩增的引物；磁体；用于核酸提取的试剂；过滤器；着色剂；和/或一种或多种反应容器。所述方法和/或试剂盒可以用于检测任何来源的核酸，包括人和其它动物、植物、致病性和非致病性生物，包括原生生物、古菌、细菌、病毒、酵母、真菌、蠕虫和其它无脊椎动物，但不限于此。在具体的实施方案中，所述方法和试剂盒可以用于检测核酸，所述核酸与人、非人动物和植物的疾病和病症有关，与环境检测有关，与食物、饮料和其它消费品的检测有关，以及与法医分析有关，但不限于此。在本说明书中，除非另有指示，所使用的“包含(comprise)”、“包括(comprises)”和“含有(comprising)”是包含地而不是排他地，所以，阐述的整数或整数的组可以包括一个或多个其它未阐述的整数或整数的组。附图说明此处，参考以下附图描述本专利技术的非限制性的实施方案。图1：单滴基因组学测定的示意图。在现场通过简单的核酸提取方法将感兴趣的样本加工至窄的浓度范围。然后检测病原体核酸，并通过重组酶聚合酶扩增等温地进行扩增。最后通过新的絮凝测定可视化测定结果。图2：精确的核酸提取过程。(A)提取过程的图示。图片显示用于提取的可能的样本，使用一次性研钵和杵手工浸渍(maceration)样本，并且使用普通的过滤移液器头清除裂解物的细胞碎片。(B)四个独立提取的DNA样本的凝胶电泳。高分子量表明提取的DNA的良好的完整性。(C)提取的核酸的光谱分析。上面：DNA，下面：RNA。图3：絮凝测定。(A)DNA介导的SPRI颗粒的絮凝的概念表征。(B)过量的引物不介导絮凝。(C)仅10％或更高的扩增导致絮凝。(D)扩增的DNA的截断浓度依赖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测核酸的方法，所述方法包括使分离的核酸与颗粒结合的步骤，其中所述分离的核酸与所述颗粒能够形成可以通过视觉观察检测的复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.23 AU 20139050521.一种检测核酸的方法，所述方法包括使分离的核酸与颗粒结合的步骤，其中所述分离的核酸与所述颗粒能够形成可以通过视觉观察检测的复合物。2.一种用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包含能够与分离的核酸形成复合物的颗粒，所述复合物能够通过视觉观察被检测到。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其进一步包含以下的一种或多种：用于核酸序列扩增的酶；一种或多种用于核酸序列扩增的引物；磁体；一种或多种用于核酸提取的试剂；过滤器；和/或一种或多种反应容器。4.根据权利要求1所述的方法或者权利要求2或权利要求3所述的试剂盒，其中所述复合物是通过核酸与颗粒絮凝形成的。5.根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中与在没有或相对低的量或浓度的核酸中观察到的絮凝相比，通过没有或相对减少的絮凝指示核酸的存在或相对量。6.根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中所述颗粒是顺磁性颗粒。7.根据权利要求6所述的方法或试剂盒，其中所述顺磁性颗粒是SPRI颗粒。8.根据权利要求7所述的方法或试剂盒，其中在絮凝缓冲液中发生絮凝。9.根据权利要求8所述的方法或试剂盒，其中所述絮凝缓冲液是pH(i)低于7；(ii)约pH 3.6-5.5；或者(iii)约pH 4.4。10.根据权利要求8所述的方法或试剂盒，其中所述絮凝缓冲液的pH是絮凝后半定量滴定的。11.根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其进一步包含着色剂，用以促进、帮助或提高核酸：颗粒复合物的视觉检测。12.根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中所述核酸是靶标核酸通过核酸序列扩增产生的扩增产物。13.根据权利要求12所述的方法或试剂盒，其中通过聚合酶链式反应(PCR)进行核酸序列扩增。14.根据权利要求12所述的方法或试剂盒，其中通过等温核酸序列扩增进行核酸序列扩增。15.根据权利要求14所述的方法或试剂盒，其中等温核酸序列扩增是重组酶聚合酶扩增(RPA)或滚环扩增(RCA)。16.根据权利要求12至15任一项所述的方法或试剂盒，其中所述扩增产物扩增自靶标核酸，所述靶标核酸通过以下连...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·特劳，E·威，J·R·博泰拉，
申请(专利权)人：昆士兰大学，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU