一种从猪肝中分离蛋白的方法技术

一种从猪肝中分离蛋白的方法，涉及生物技术领域，将新鲜猪肝匀浆后的沉淀物与乙醇混合进行脱脂反应，得脱脂猪肝粉；脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液混合后，置于超声反应器中进行间歇式超声提取，提取溶液进行离心，取上清液；采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，再经离心、预冻、冷冻干燥，得蛋白干燥粉末。本发明专利技术利用超声波技术破坏细胞膜促进细胞内活性蛋白成分的充分溶出，利用低功率超声波穿透式作用，在降低活性蛋白结构破坏风险的同时促进蛋白溶出、节省提取时间，提高提取效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及从猪肝中分离作为抗氧化剂和人体营养补充剂的蛋白技术，也属于保健食品

技术介绍
据国家统计局（NBSC）统计得知，于2011年我国每年屠宰猪总量达到7.96千万吨以上，其中猪肝总量已达60万吨。肝脏中富含蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质。每百克猪肝含蛋白质21.3g，是猪肉的两倍。肝脏中的蛋白被认为是一种优质完全蛋白质，是公认的高级蛋白，含量之高是许多其他蛋白源无法与之相比的。但大部分以鲜销为主，且由于其特殊的气味未能被充分利用，从而没有完全体现出其高附加值。另一方面，由于我国长期以来对猪肝方面的加工利用率低下，除了干燥粉碎后应用于畜禽饲料和营养源添加外，甚至有些猪肝粉被当做肥料或者直接废弃掉，因此，造成了巨大的资源浪费。食物短缺，蛋白质不足，是第三世界普遍存在的问题，也可称为发展中国家存在的生命能源危机，与当前发达国家面临的工业能源危机并列为世界性的两种能源危机。农畜产品是目前食用蛋白质的主要来源。传统蛋白质生产数量逐年增加，但其增加速度小于人口的增长，因此蛋白质人均占有量的提高被人口不断增多而抵消了不少，发展中国家这种现象尤其明显。随着生活水平的提高，改善营养，提高食物口感，在膳食中增加动物蛋白的数量，是一自然趋势。从我国居民蛋白质的摄入量看，据2010年膳食调查，其中优质蛋白质摄入量在地区之间存在着很大差距，高者占41%，低者仅占18%。这说明，如何提高蛋白质尤其是优质蛋白质的供给水平，已成为改进居民膳食营养的一个关键。从肝脏中提取蛋白的方法主要有水溶液提取法、有机溶剂提取法、碱溶酸沉法、蔗糖密度梯度离心法、超声波萃取法、双水向萃取法、微波辅助提取法、酶法等。中国专利CN103988971于2014年08月20日公开了一种可食用禽肝脏蛋白的提取方法，用氢氧化钠溶液调节pH11.0-11.5，离心得中间层再用盐酸调pH5.0-5.5，再次离心得沉淀即是肝脏蛋白。中国专利CN102250994于2011年11月23日公开了一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，制得的ACE抑制肽可应用于开发具有降血压功能食品及医药领域。中国专利CN101629168A于2010年01月20日公开了以动物肝脏为原料，经细胞破碎、溶液浸泡、固液分离、膜分离后的一种以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和水产诱食剂的工艺。目前，在动物肝脏的研究中，对各种酶的提取和纯化研究较多，但对蛋白还缺乏系统深入的研究，传统提取方法效率低、操作复杂、周期长。因此，选择合适的提取技术，获得提取率较高的肝脏分离蛋白，并且还能保证其功能性质和活性将成为一个热点研究方向。本专利技术的详细内容：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的响应曲面法优化猪肝分离蛋白的超声辅助碱溶提取方法。本专利技术包括以下步骤：1）将新鲜猪肝匀浆后过滤，取沉淀物；2）将沉淀物与乙醇混合进行脱脂反应，经离心，收集沉淀干燥，得脱脂猪肝粉；3）将脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液混合后，置于超声反应器中进行间歇式超声提取，得提取溶液；4）将提取溶液进行离心，取上清液；5）采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，然后于2～6 ℃温度环境下静置后再经离心，取得沉淀于-70～-80 ℃下预冻，最后在大气压力为10～100 Pa、温度为-55～-70 ℃条件下冷冻干燥24～72 h，得蛋白干燥粉末。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点：1、本专利技术利用了超声波技术进一步破坏细胞膜促进细胞内活性蛋白成分的充分溶出，利用低功率超声波穿透式作用，在降低活性蛋白结构破坏风险的同时促进蛋白溶出、节省提取时间，提高提取效率。2、与正交法相比，本专利技术采用Design Expert 8.0.6.1（BBD）中心组合设计模型的响应面分析法，用3因素3水平及少量的实验组（仅17组实验）就可得出优化结果，获得最佳产率，在提高提取效率的同时降低了能耗和污染物的排放，具有工业化生产的试剂意义。3、本专利技术获得的猪肝分离蛋白最终产品为淡黄色粉末，易溶于水，经氨基酸组分分析，其碱性氨基酸含量达15.93% ，疏水性氨基酸含量高达36.73%，E/T > 43%。抗氧化实验结果表明该猪肝分离蛋白能显著清除羟自由基，其IC50为1.6732 mg/mL。测试其体外消化率，结果显示其消化率高达94%，与原猪肝及常规碱提法相比，均具有显著性差异，表明合适的超声处理可改善猪肝分离蛋白的营养价值。从猪肝中分离出的蛋白可作为抗氧化剂，可制备成人体营养补充剂。 进一步地，为了使猪肝中的内源酶失活，本专利技术所述步骤1）中，取新鲜猪肝先用生理盐水冲洗，再剔除膜和结缔组织，经切碎后与沸水混合，再经煮沸8～15 min，然后置于高速匀浆机中进行匀浆处理。所述步骤2）中，用于与沉淀物混合的乙醇为体积百分数为90%的乙醇水溶液，沉淀物与乙醇水溶液的体积比为1∶1～3，可使脂肪率降低至5%以下。所述步骤2）中，所述脱脂反应是在反应体系的温度为60～80℃的条件下进行20～40min，脱脂反应结束后，经冷却至室温再离心。也使脂肪率降低至5%以下。为了使蛋白不易变性，所述步骤2）中，所述干燥的温度环境为40～60℃。为了提高蛋白得率，所述步骤3）中，所述氢氧化钠水溶液的质量百分数为0.50～1.0%，脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液的混合比为1g∶40～80 mL。同理，为了提高蛋白得率，所述步骤3）中，所述超声的功率为200～300 W，温度为40～60℃，以超声工作时间2 s和停歇3 s的间歇式超声提取30～50 min。所述步骤5）中，所述盐酸水溶液的浓度为0.50～1.0mol/L，本专利技术仅需少量盐酸水溶液即可获得蛋白沉淀物。附图说明图1为超声波功率对蛋白提取率的影响图。图2为超声时间对蛋白提取率的影响图。图3为液料比对蛋白提取率的影响图。图4为超声温度对蛋白提取率的影响图。图5为氢氧化钠浓度对蛋白提取率的影响图。图6为本专利技术抗氧化评价结果。图7为本专利技术体外消化率。具体实施方式本专利技术中猪肝分离蛋白用Lowry法测定蛋白质含量。本专利技术中超声波技术采用聚能式探头超声，超声方式为工作2 s，停歇3 s。本专利技术中猪肝分离蛋白的抗氧化活性的测定包括：猪肝分离蛋白对羟基自由基的清除效果。本专利技术中采用清除羟自由基试验考察猪肝分离蛋白的抗氧化活性。研究结果表明，与常规碱提法相比，超声作用后猪肝分离蛋白的抗氧化活性好。因此本专利技术的猪肝分离蛋白可用作抗氧化的功能性食品。本专利技术中体外消化实验所使用的胃蛋白酶（国药公司产品），酶活1∶30000；胰酶（国药公司产品），酶活1∶4000。为了更清楚地说明本
技术实现思路
，用具体实施例说明如下，具体实施例不限定本
技术实现思路
范围。一、制备蛋白提取物干燥粉末：实施例1将新鲜猪肝用生理盐水冲洗，剔除膜和结缔组织，切碎；加入3～6倍的沸水，煮沸8～15 min，置于高速匀浆机中，以8000～10000 rpm下匀浆2~4 min；过滤后沉淀加入1～3倍体积的90%的乙醇，60～80 ℃下脱脂20～40 min，冷却至室温后，3000～5000 g 离心10～20 min，收集沉淀；于烘箱中40～60 ℃下干燥至恒重，研磨，取得脱脂猪肝粉，于干燥皿中保存备用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：1）将新鲜猪肝匀浆后过滤，取沉淀物；2）将沉淀物与乙醇混合进行脱脂反应，经离心，收集沉淀干燥，得脱脂猪肝粉；3）将脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液混合后，置于超声反应器中进行间歇式超声提取，得提取溶液；4）将提取溶液进行离心，取上清液；5）采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，然后于2～6℃温度环境下静置后再经离心，取得沉淀于‑70～‑80℃下预冻，最后在大气压力为10～100 Pa、温度为‑55～‑70℃条件下冷冻干燥24～72h，得蛋白干燥粉末。

【技术特征摘要】
1.一种从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：1）将新鲜猪肝匀浆后过滤，取沉淀物；2）将沉淀物与乙醇混合进行脱脂反应，经离心，收集沉淀干燥，得脱脂猪肝粉；3）将脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液混合后，置于超声反应器中进行间歇式超声提取，得提取溶液；4）将提取溶液进行离心，取上清液；5）采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，然后于2～6℃温度环境下静置后再经离心，取得沉淀于-70～-80℃下预冻，最后在大气压力为10～100 Pa、温度为-55～-70℃条件下冷冻干燥24～72h，得蛋白干燥粉末。2.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1）中，取新鲜猪肝先用生理盐水冲洗，再剔除膜和结缔组织，经切碎后与沸水混合，再经煮沸8～15min，然后置于高速匀浆机中进行匀浆处理。3.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2）中，用于与沉淀物混合的乙醇为体积百分数为90%的乙醇水溶液，沉淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹烨，王道营，卞欢，吴海虹，张牧焓，李鹏鹏，王立，诸永志，徐为民，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32