一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法，用于小麦及其制品等中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。通过将NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光材料与赭曲霉毒素A核酸适配体连接形成信号探针，再通过碱基互补配对原则与适配体互补寡核苷酸单链修饰的Fe3O4磁性纳米材料形成纳米复合物，此时上转换发光信号达到最大；当检测体系中存在OTA时，OTA与OTA适配体特异性结合，从而使双链解链，通过监控近红外光区804nm处的上转换发光信号强度，能够定量检测OTA，线性范围为0.01‑100ng/mL，检出限为0.005ng/mL。本发明专利技术用于OTA检测具有灵敏度高、快速简便的优点，并应用于啤酒样品的检测，结果准确可靠。
【技术实现步骤摘要】
一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法，涉及纳米材料和分析化学
，用于对食品中赭曲霉毒素A进行检测。
技术介绍
赭曲霉毒素A(Ochratoxins A，OTA)主要由纯绿青霉(Penicillium Verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus achraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三种真菌产生，不少其他产毒菌株也不断地被报道。OTA主要污染植物性产品，比如谷物、豆类、花生、葡萄干、咖啡、啤酒和红酒，不少报道显示，部分动物性产品中也存在OTA，这是因为食物链蓄积作用，动物摄食部分受OTA污染的植物性产品导致OTA在动物体内富集。OTA具有较强的肝脏、肾脏和神经毒性和致畸、致癌、致突变作用，对人类身体健康和食品安全造成很大的危害。因此，建立准确、灵敏、快速的OTA检测技术对于食品安全具有重大意义。目前检测OTA的主要方法有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质联用法(LC-MS/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析分析法(GICA)等。ELISA主要基于抗原抗体亲和反应，常用于OTA现场快速检测和大批量样品筛选。但抗体易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或者细胞实验，繁琐费时，成本较高；而基于仪器的分析方法则需要大量的人力和财力投入，常常只用于实验室分析。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法是很有必要的。核酸适配体(Aptamer)通过指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术从体外筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。这种寡核苷酸序列形成的高级结构能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相比，适配体的靶分子范围广，体外筛选，易人工合成和修饰，分子较小，稳定性好，对温度不敏感，容易保存，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。近年来，新型纳米材料在分析检测中的快速发展受到越来越多的科研工作者的青睐，并涌现出了很多具有优秀特性的纳米材料。其中上转换发光纳米材料引起独特的光学特性被人们所熟知。上转换发光纳米材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)的发光机制是基于双光子或者多光子过程，是一种将红外光转变成可见光的有效途径。相对于传统的有机荧光染料和其他荧光纳米材料，上转换发光纳米材料作为完全惰性的无机发光材料具有很大的优势，光化学性质稳定，单色性强，具有较长的发光寿命，可以选择不同的基质材料和掺杂离子来调节上转换发光，真正实现单激发多发射，有利于生物体系中多组分标记同时检测。鉴于上述优点，上转换发光纳米材料已成为一种优秀的生物标记材料被广泛的用于生物监测分析领域。本专利技术首先合成了在804nm处有强发射峰的近红外上转换发光纳米材料，其次用一步合成法制备了氨基化Fe3O4磁性纳米材料，并分别在近红外上转换发光纳米材料上修饰OTA适配体和在Fe3O4磁性纳米材料上修饰互补寡核苷酸链，分别组成信号探针和磁性探针，基于两者碱基互补配对原则，使得两种探针形成近红外上转换发光纳米材料-磁性纳米材料纳米复合物，此时的发光强度达到最大。当加入不同量的OTA时，OTA与适配体进行特异性结合，使得双链结构解离，部分近红外上转换发光纳米材料从磁性纳米材料表面脱落，近红外上转换发光强度减弱，以980nm激光作为激发光源记录近红外上转换发光检测信号，通过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品的检测，建立标准曲线，达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。该专利技术可以用于啤酒、玉米、谷物、饲料及其制品等样品中赭曲霉毒素A含量的检测。
技术实现思路
：一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法：将NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料和Fe3O4磁性纳米材料分别通过EDC/NHS反应和戊二醛交联法偶联亲和素，利用亲和素和生物素之间的高亲和力，分别偶联生物素化OTA适配体和互补链，基于杂交反应使两种材料形成纳米复合物，此时纳米复合物具有最大的发光信号。当这个复合物体系中加入目标物OTA后，由于OTA适配体与OTA的特异性识别结合，OTA适配体优先结合靶标OTA，导致OTA适配体与互补链的解离，造成近红外上转换发光纳米材料和磁性纳米材料的分离，通过外加磁场作用，收集得到的纳米复合物中近红外上转换发光纳米材料减少，此时的发光信号就会相应的减弱，根据加入靶标浓度与发光信号强度变化量之间的关系，可以实现OTA的定量检测；步骤为：(1)通过高温热解法技术，制备NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料，并对其做表面修饰。称取YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O，TmCl3·6H2O(Ln:78mol％Y3+，20mol％Yb3+，2mol％Tm3+；总共1mmol)加入到100mL三口烧瓶中，加入6mL油酸以及15mL 1-十八烯。在搅拌下，逐渐升温至160℃，待形成均一的溶液后，自然冷却至室温。准确称取2.5mmol NaOH和4mmol NH4F溶于10mL甲醇溶液中。将上述溶液缓慢加入到三口烧瓶中，磁力搅拌30min。再将溶液缓慢加热去除甲醇，氩气保护下加热到300℃，并且持续1h。反应结束后，自然冷却至室温，用水和乙醇离心所得材料清洗三次，储存备用。(2)利用配体交换法对上转换发光纳米颗粒进行表面羧基化修饰。称取30mg油酸修饰NaYF4:Yb0.2,Tm0.02UCNPs分散于4mL氯仿溶液中。于圆底烧瓶中，加入200mg聚丙烯酸(相对分子量2000)和8mL超纯水，搅拌均匀充分溶解。将UCNPs氯仿溶液缓慢加入到圆底烧瓶中，磁力搅拌24h后，离心收集材料，用超纯水清洗数次，得到聚丙烯酸修饰NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料，储存备用。(3)采用一步溶剂法制备氨基化Fe3O4磁性纳米材料。称取2.0g无水醋酸钠，1.0g FeCl3·6H2O和6.5g 1，6-己二胺加入30mL乙二醇中，磁力搅拌下加热至50℃，待形成透亮均一的胶体溶液后，转移到带内衬的反应釜中，在198℃件下反应6h。待反应釜冷却后，将釜内液体转移到烧杯中，磁铁分离收集黑色固体，弃去上清，反复清洗几次。所得黑色固体在60℃条件下过夜干燥备用。(4)利用EDC/NHS法将羧基化上转换发光纳米材料与亲和素(Avidin)偶联。称取10mg聚丙烯酸修饰的NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料分散于5mL 10mmol/L MES(pH 5.6)缓冲液中，充分超声分散，加入0.6mL 2mg/mL EDC溶液和0.2mL 2mg/mL NHS溶液，37℃摇床中活化2h。离心收集材料，用磷酸缓冲液清洗三次。然后分散于磷酸缓冲液中，加入1mL 0.5mg/mL亲和素溶液，在37℃摇床中反应12h。离心收集材料和上清，测定亲和素反应前后的紫外吸收。(5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于：将赭曲霉毒素A(OTA)适配体与近红外NaYF4:Yb0.2,Tm0.02上转换发光纳米材料偶联形成信号探针，同时生物素化OTA适配体互补寡核苷酸单链与Fe3O4磁性纳米材料连接形成磁性探针，通过双链杂交形成NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料—Fe3O4磁性纳米材料复合物；向检测体系中加入OTA，OTA会优先与适配体结合，导致互补链与OTA适配体解离，从而使一部分NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料—Fe3O4磁性纳米材料复合物分解，充分磁分离去上清后，利用980nm激发，收集上转换发光在804nm处的发光信号；在0.01‑100ng/mL浓度范围内，OTA的浓度与804nm处上转换发光信号变化呈正相关，建立标准曲线，达到对OTA的定量检测，可用于啤酒中OTA的检测。
【技术特征摘要】
1.一种基于近红外上转换发光标记和磁分离的赭曲霉毒素A检测方法，其特征在于：将赭曲霉毒素A(OTA)适配体与近红外NaYF4:Yb0.2,Tm0.02上转换发光纳米材料偶联形成信号探针，同时生物素化OTA适配体互补寡核苷酸单链与Fe3O4磁性纳米材料连接形成磁性探针，通过双链杂交形成NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近红外上转换发光纳米材料—Fe3O4磁性纳米材料复合物；向检测体系中加入OTA，O...
【专利技术属性】
技术研发人员：王周平，戴邵亮，吴世嘉，段诺，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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