本发明专利技术公开了抗CTLA‑4的纳米抗体Nb36及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的纳米抗体，包含决定簇互补区和框架区；所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第26‑32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第48‑55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第94‑112位氨基酸。本发明专利技术的纳米抗体Nb36可以与T细胞及CTLA‑4结合，可应用于CTLA‑4分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CTLA‑4活性和促进T细胞增殖的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域中抗CTLA-4的纳米抗体Nb36及其制备方法与应用。
技术介绍
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocytic associated antigen,CTLA-4/CTLA4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是活化T细胞表面表达的一种跨膜糖蛋白分子，属免疫球蛋白超家族成员，对T细胞增殖起负性调节作用，在免疫应答中起重要调节作用。CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应、肿瘤及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。1993年Hamers等报道，骆驼体内存在着天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody，Nb)。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。Nb具有许多独特的性质，很适合进行基因改造，在疾病的精确诊断和靶向治疗等方面展现了广阔的应用前景。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何治疗肿瘤。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了纳米抗体。本专利技术所提供的纳米抗体，其名称为Nb36，包含决定簇互补区；所述Nb36的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第26-32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第48-55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第94-112位氨基酸。上述纳米抗体中，所述Nb36由所述决定簇互补区和框架区组成。上述纳米抗体中，所述Nb36为下述a)或b)：a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第1-123位氨基酸的纳米抗体；b)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.5的纳米抗体。为了使所述Nb36便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.5的第1-123位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL HA 9 YPYDVPDYA 所述Nb36可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述Nb36的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.6的第1-369位核苷酸或SEQ ID No.6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.6的第1-369位核苷酸编码SEQ ID No.5的第1-123位氨基酸的纳米抗体，SEQ ID No.6的第370-426位核苷酸编码SEQ ID No.5的第124-142位氨基酸的纳米抗体，SEQ ID No.6所示的DNA编码SEQ ID No.5所示的纳米抗体。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了与所述Nb36相关的生物材料。本专利技术所提供的与所述Nb36相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：B1)编码所述Nb36的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述生物材料中，B2)所述的含有编码所述Nb36的核酸分子的表达盒(Nb36基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Nb36的DNA，该DNA不但可包括启动Nb36基因转录的启动子，还可包括终止Nb36基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述Nb36基因表达盒的重组载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述生物材料中，所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pComb3中得到的重组载体。在本专利技术的一个实施例中，B3)所述重组载体为将所述Nb36的编码基因(核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.6的第1-369位核苷酸)导入pComb3中得到的重组载体pComb3-Nb36，重组载体pComb3-Nb36表达SEQ ID No.5所示的纳米抗体Nb36。上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。上述生物材料中，所述转基因动物细胞系不包括繁殖材料；所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入到大肠杆菌WK6中得到的重组微生物。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的B1)所述Nb36的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术的B1)所述Nb36的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码所述Nb36且具有Nb36活性，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码SEQ ID No.5或SEQ ID No.5的第1-123位氨基酸所示的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、8本文档来自技高网...
【技术保护点】
纳米抗体，包含决定簇互补区；所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第26‑32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第48‑55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第94‑112位氨基酸。
【技术特征摘要】
2015.07.20 CN 201510426736X1.纳米抗体，包含决定簇互补区；所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第26-32位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第48-55位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.5的第94-112位氨基酸。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体由所述决定簇互补区和框架区组成。3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于：所述纳米抗体为下述a)或b)：a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.5的第1-123位氨基酸的纳米抗体；b)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.5的纳米抗体。4.与权利要求1或2或3所述纳米抗体相关的生物材料，为B1)至B12)中的任一种：B1)编码权利要求1或2或3所述纳米抗体的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述纳米抗体的CDR1的编码序列为序列表中SEQ ID No.6的第75-96位核苷酸；所述纳米抗体的CDR2的编码序列如序列表中SEQ ID No.6的第142-165位核苷酸；所述纳米抗体的CDR3的编码序列为序列表中SEQ ID No.6的第280-336位核苷酸。6.根据权利要求4或5所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为下述1)或2)或3)或4)：1)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的cDNA分子或DNA分子；2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.6的第1-369位核苷酸的cDNA分子或DNA分子...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，赵永祥，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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