本发明专利技术公开了一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，包括：(1)采集大鲵样本，并提取基因组DNA；(2)合成大鲵特异线粒体DNA引物；(3)对大鲵样本进行PCR扩增并对PCR扩增产物测序；(4)对获得的序列与参考序列进行比对；(5)根据相应位点的序列特征，判断样本所属的群体。本发明专利技术以大鲵线粒体DNA序列作为区别中国大鲵种群的序列标记，通过与参考序列的序列特征进行比对，能够快速准确的对目标种群进行鉴定。可用于对大鲵养殖场的大鲵个体进行鉴定，确定个体来源；在亲本繁殖时可辅助育种选择。还可应用于增殖放流样本的鉴定，确定其所属的群体，然后放流到适合的区域，避免放流群体对野生群体的种质混杂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物鉴定
，具体地说，涉及一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法。
技术介绍
中国大鲵(Andrias davidianus)是现存两栖类当中，体型最大的一种，最大个体体长可达1米以上，体重可达8公斤以上。中国大鲵仅分布于我国，为我国特有，分布区域包括北京、河北、河南、山西、陕西、甘肃、青海、四川、贵州、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江、江西、福建、广东和广西等省、市、区。由于具有重要的科研和经济价值，市场需要很大，导致中国大鲵过度捕捞，加上栖息地减少，目前大鲵野生资源极为稀少，已我国被列为国家二级保护动物。当前国家在不断加强野生大鲵保护的力度，设置有国家级、省级、市县级等各类中国大鲵保护保护区十余个，以保护野生中国大鲵资源。同时，我国还有很多规模不一的养殖场，其繁殖和养殖的大鲵不仅用于市场消费，也有部分用于增殖放流，补充野生资源。对大鲵进行保护，不仅要保护大鲵的数量，也要保护大鲵的遗传多样性。大鲵属两栖类动物，生活依赖河流水体，行动缓慢。山脉水系的隔离、栖息地的破碎化在长期的演化中引起大鲵的地理分化和遗传结构变异。寻找区分不同地理群体的遗传标记，具有很高的应用价值。一方面，在保护工作实践中，存在遗传分化的每一个群体应作为不同种质资源管理单元，加以保护，避免遗传多样性丧失。另一方面，也用于大鲵养殖场的亲本来源进行鉴定，区分种质资源，避免在人工繁殖时造成种质混杂。同时还可以对用于放流的大鲵进行鉴定，避免将不同地理群体的大鲵相互放流，造成野生群体种质混杂。目前，一些工作者通过体表花纹辨认不同地理群体的大鲵，但是体表花纹并不稳定，没有固定的标志，难以作为群体划分的标准。国内外有一些报道，采用线粒体DNA分析少量样本，发现中国大鲵群体存在一定的遗传差异，但没有提出明确的群体标记。线粒体DNA序列变异速率较快，不同隔离群体容易产生可识别的序列标记。因此，利用线粒体DNA序列作为区别中国大鲵群体的标记既方便有可靠。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题是现有技术中没有对大鲵种群鉴定较为方便可靠的方法。提供一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集大鲵样本，并提取基因组DNA；(2)合成大鲵特异线粒体DNA引物；(3)对大鲵样本进行PCR扩增并对所述PCR扩增产物测序；(4)对获得的序列与参考序列进行比对；(5)根据相应位点的序列特征，判断样本所属的群体。进一步的，步骤(2)中所述大鲵特异线粒体DNA引物为L14764和H16062，所述L14764如SEQ ID NO.1，所述H16062如SEQ ID NO.2。进一步的，步骤(3)中所述PCR扩增反应体系为：总体积50μL，包含10×PCR buffer 5μL、10mmol/L的dNTPs 0.5μL、10μmol/L的引物L14764和H16062各2μL、Taq DNA聚合酶2单位、模板DNA20～100ng，补充灭菌双蒸水至50μL。进一步的，步骤(3)中所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃再延伸8min。进一步的，步骤(3)中所述测序方法为：将所述PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物凝胶回收试剂盒纯化回收，利用引物L14764和H16062对回收产物进行双向测序。进一步的，步骤(4)具体为：将步骤(3)获得的序列与参考序列组进行比对，以所述序列组的起始序列所设定的位点为准，参照相应位点的序列特征，确定所测的样本归属的群体。进一步的，步骤(4)中所述种群的特征序列如下：POP1：位点654～903，910～920，927～972缺失，904～909为GCAGTG、GCAGAG或GCAGGG，位点921～926为CGAATT；P0P2：位点654～659，664～903，910～920，930～974缺失，位点660～663为T，位点904～909为ACAGAG；POP3：位点654～659，664～903，910～920，929～974缺失，位点660～663为T；位点904～909为ACAGGG；POP4：位点653～659，664～895缺失，位点593～605为TTTTCACTTTTA，位点660～663为TTTT；POP5：位点653～659，664～895缺失，位点593～605为TTTCACTTTTTCA，位点660～663为TTTT；POP6：656～659，664～896缺失，位点610～619为TCTAAGGGT，位点653～655为ATA，897～901为GAGAT，973～977为GAAA，1005～1007为CAA；POP7：位点664～895缺失，位点653～663为AAAATATTTTT，位点897～901为ATGTT；POP8：位点364～368为GGGGG，位点664～802为GATGTACTTTCTTTTTGCCTATGCAATTCTCCGATCAACCCCAAACAAACTCGGAGGCGTCCTAGCCTTAGGGGCCTCCATTTTCATTTTAATCCTATACCCCTTCTTCATACATCAAAACAACGAGGTTTAATATTCC。进一步的，步骤(4)中所述种群POP1-POP8的分布范围如下：POP1群体主要分布在湖南、湖北、河南、陕西、山西、安徽、甘肃、重庆、贵州、云南、四川、广西融水等地区；POP2群体主要分布在广西资源县；POP3群体主要分布在河南栾川、安徽来榜及陕西安康等地区；POP4群体主要分布在安徽黄山地区；POP5群体主要分布在江西、浙江、安徽来榜等地区；POP6群体主要分布在安徽黄山和浙江丽水部分地区；POP7群体主要分布在湖南永定和龙山、湖北恩施、重庆涪陵和武隆、贵州、云南、广西融水等地区；POP8群体主要分布在广西兴安县。进一步的，步骤(1)中所述采集中国大鲵样本，包括鳍条、血液、肌肉、新鲜蜕皮、粘液或口腔上皮细胞。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术以大鲵线粒体DNA序列作为区别中国大鲵种群的序列标记，通过与参考序列的序列特征进行比对，能够快速准确的对目标种群进行鉴定。2)本专利技术的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。3)本专利技术中选用的实验试剂均为常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。4)本专利技术可用于对大鲵养殖场的大鲵个体进行鉴定，确定个体来源；在亲本繁殖时可辅助育种选择。5)本专利技术还可应用于增殖放流样本的鉴定，确定其所属的群体，然后放流到适合的区域，避免放流群体对野生群体的种质混杂。当然，实施本专利技术的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例(1)样本采集及DNA提取在中国广西兴安(GXXA)、湖南龙山(HNLS)、江西静安(JXJA)、安徽黄山(AHHS)、湖北来凤(HBLF)、浙江丽水(ZJLS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集大鲵样本，并提取基因组DNA；(2)合成大鲵特异线粒体DNA引物；(3)对大鲵样本进行PCR扩增并对所述PCR扩增产物测序；(4)对获得的序列与参考序列进行比对；(5)根据相应位点的序列特征，判断样本所属的群体。
【技术特征摘要】
1.一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采集大鲵样本，并提取基因组DNA；(2)合成大鲵特异线粒体DNA引物；(3)对大鲵样本进行PCR扩增并对所述PCR扩增产物测序；(4)对获得的序列与参考序列进行比对；(5)根据相应位点的序列特征，判断样本所属的群体。2.如权利要求1所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步骤(2)中所述大鲵特异线粒体DNA引物为L14764和H16062，所述L14764如SEQ ID NO.1，所述H16062如SEQ ID NO.2。3.如权利要求2所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增反应体系为：总体积50μL，包含10×PCR buffer 5μL、10mmol/L的dNTPs 0.5μL、10μmol/L的引物L14764和H16062各2μL、Taq DNA聚合酶2单位、模板DNA20～100ng，补充灭菌双蒸水至50μL。4.如权利要求3所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃再延伸8min。5.如权利要求4所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步骤(3)中所述测序方法为：将所述PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物凝胶回收试剂盒纯化回收，利用所述引物L14764和H16062对回收产物进行双向测序。6.如权利要求5所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步骤(4)具体为：将步骤(3)获得的序列与参考序列组进行比对，以所述序列组的起始序列所设定的位点为准，参照相应位点的序列特征，确定所测的样本归属的群体。7.如权利要求6所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步骤(4)中所述种群的特征序列如下：POP1：位点654～903，910～920，927～972缺失，904～909为GCAGTG、GCAGAG或GCAGGG，位点921～926为CGAATT；P0P2：位点654～659，6...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪登强，梁志强，危起伟，伍远安，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，湖南省水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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