本发明专利技术涉及基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用。基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还涉及基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法。本发明专利技术首次发现不同株的木霉属真菌的线粒体NAD5基因序列均不相同，并以该序列为特征片段建立木霉菌的DNA条形码数据库，对木霉属真菌进行分类鉴定，该方法实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用，特别涉及基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定引物及鉴定方法，属于微生物
技术介绍
木霉(Trichoderma spp.)菌属于半知菌类的丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，广泛存在于土壤、腐烂的木材及植物残体等基质中。木霉所产生的纤维素酶、半纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶等，在食品、卫生、饲料、纺织、造纸等领域广泛应用，是重要工业酶制剂的生产菌。有些木霉菌能促进植物生长，抑制植物病原真菌，在农业生产上作为重要的植病生防菌使用。种类鉴定往往是生物学研究的第一步，对种类的准确鉴定能够使人们获得研究目标生物的背景信息，比如生理生化特性、生态学功能、效益与风险等。木霉菌形态多样、种类繁多、功能各异，准确快速地对其进行分类鉴定，对木霉菌的研究和利用有重要的意义。传统的木霉菌鉴定方法是基于形态学分类研究的基础上，主要根据产孢结构、分枝方式、孢子形态、颜色、大小、瓶梗的形态、数目和着生方式等形态特征进行分类。此外，从能分离到木霉菌有性型形态入手，研究其无性型，也是一种有效的鉴定方法。但是由于木霉菌形态特征的可变性比较强，表现不够稳定，因此利用形态学特征进行鉴定时，出错的可能性比较大。而且，目前能发现有性型的木霉种类非常少，远不能满足分类鉴定的需求。2002年，Tautz D等在Nature上首先提出要用DNA序列作为生物分类系统的主要平台(DNA Taxonomy)，随后2003年加拿大动物学家Paul Hebert首次提出DNA条形码(DNA Barcoding)的概念。DNA条形码是指利用一段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和大批量的物种识别和鉴定。目前在木霉菌上使用的DNA条形码序列主要有内转录间隔区序列(ITS)、转录延伸因子Iα亚基序列(tef1)等，上述DNA条形码系统为快速准确的鉴定木霉菌提供了有力的工具。然而，现有木霉菌DNA条形码系统仍存在一些不足。例如，ITS条形码系统的区分能力有限，对于近源种往往无法进行明确的区分；tef1条形码系统含有三个系统发生标记，即第4、5内含子和第6外显子，由于对哪个发生标记作为鉴定标准的意见不统一，因此该条形码系统鉴定结果的准确性值得商榷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用。与现有方法中的ITS、tef1序列相比，线粒体NAD5基因进化速率较快，即使近缘物种区分度也很好；密码子保守性高、引物通用性强，目的片段更短更易扩增；约700bp的序列长度不需要双向测序，分类鉴定成本更低。本专利技术技术方案如下：基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体序列如下：SEQ ID NO.1(上游引物)：5’-AATCATGCTTTCTATAAAGGA-3’SEQ ID NO.2(下游引物)：5’-GAATTCAACTAAGAAACGTTG-3’一种基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法，步骤如下：(1)提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA，制得基因组DNA；(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用上述基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物进行PCR扩增，纯化，制得PCR扩增产物；(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行测序，将测序结果与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法或基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或遗传距离最小的对应种类即为待鉴别真菌的物种。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA采用酚/氯仿抽提法。酚/氯仿抽提法为本领域常规的真核生物DNA提取方法，参见《分子克隆实验指南》。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系为50μL：根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的纯化为采用质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，利用纯化试剂盒回收纯化。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中已建立的木霉属真菌DNA条形码数据库为采用已经准确分类鉴定的木霉属真菌，按照上述步骤(1)获得基因组DNA，然后按照上述步骤(2)获得PCR扩增产物，再经步骤(3)测序后，建立由含有已知木霉属真菌对应的PCR扩增产物序列组成的木霉属真菌DNA条形码数据库。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法进行物种鉴定的步骤如下：将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件计算PCR扩增产物的测序结果的序列与其它木霉菌的Kimura-2-parameter遗传距离，计算种内、种间变异值，当待鉴定菌株与数据库中的基因片段比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，当最小变异值等于或小于某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种；根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定的步骤如下：将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件构建NJ、ML、ME、UPGMA系统发育树，检验PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中序列聚类在一起的物种，若待鉴定菌株与数据库中的物种构成单支系，则待鉴定的木霉属真菌样品鉴定为该物种。有益效果本专利技术首次发现不同株的木霉属真菌的线粒体NAD5基因序列均不相同，并以该序列为特征片段建立木霉菌的DNA条形码数据库，对木霉属真菌该特征片段进行扩增、测序，然后将待鉴定的木霉属真菌样品的序列与DNA条形码数据库进行比对，根据比对结果对木霉菌进行分类鉴定，该方法实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。附图说明图1所示为部分木霉菌株的NAD5基因PCR扩增产物的电泳检测结果照片；图中：Marker：DL2000；1：T.guizhouense STSF1.0243；2：T.velutinum STSF1.0246；3：T.citrinoviride STSF1.0066；4：T.gamsii KUC1747；5：SP1；图2所示为NAD5序列系统发育树并分析亲缘关系图。具体实施方式：下面结合实施例和附图对本专利技术的技术方案作进一步说明，可以用于以下典型实验方案达到
技术实现思路
的目的，本专利技术的保护范围并不限于此，凡依照本专利技术公开序列和引物进行的PCR所做的修改、优化的实施内容，均属于本专利技术的保护范围。实施例1木霉菌属DNA条形码即NAD5基因序列片段数据库的建立，步骤如下：(1)收集不同的木霉菌株，根据菌株的形态特征，然后提取其基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法，其特征在于，步骤如下：(1)提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA，制得基因组DNA；(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物进行PCR扩增，纯化，制得PCR扩增产物；(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行测序，将测序结果与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法或基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或遗传距离最小的对应种类即为待鉴别真菌的物种。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA采用酚/氯仿抽提法。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系为50μL：5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的纯化为采用质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，利用纯化试剂盒回收纯化。7.如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：张新建，周红姿，张广志，吴晓青，赵晓燕，谢雪迎，周方园，李天元，
申请(专利权)人：山东省科学院生态研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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