本发明专利技术涉及电化学传感器领域，具体公开了一种脱氢酶电极及其应用。所述脱氢酶电极包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的催化剂层和涂敷于所述催化剂层上的酶层；其中，所述酶层包括谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶。本发明专利技术利用抗坏血酸氧化酶能够将抗坏血酸氧化，成功的消除了实际动物脑中抗坏血酸的干扰影响，实现了在线实时的检测目标物。并通过进一步调整脱氢酶电极的工作环境，提高灵敏度，降低了检测限，使之用于活体中低浓度的谷氨酸检测成为可能。本发明专利技术脱氢酶电极的制备方法简易、重现性好、检测限低、灵敏度高，可用于实际动物脑中谷氨酸的在线实时检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及电化学传感器领域，具体地说，涉及一种脱氢酶电极。
技术介绍
谷氨酸是脑神经系统中重要的神经递质，与其它神经递质(如多巴胺、乙酰胆碱、神经肽类等物质)和神经调质(如抗坏血酸)以及葡萄糖、乳酸、离子等物质共同构成复杂的脑化学体系，共同实现神经元的功能运转。有研究报道，谷氨酸与精神分裂症，帕金森综合症，中风等脑神经性疾病有重要的关联，它通过大量的\载体\进行自身的转运及信号传导，以完成机体的生理病理状态的调节，因此定量监测体内谷氨酸的含量是非常必要的,特别是发生动态变化时，如脑缺血,帕金森病,癫痫,肌萎缩性脊髓侧索硬化症和精神分裂症等。目前检测谷氨酸的方法有液相色谱法、毛细管电泳、荧光法和电化学方法等。色谱法需要繁杂的样品前处理过程，使用方法也复杂耗时，且仪器昂贵；毛细管电泳方法重现性差，不能真实准确的定量；荧光方法虽然快速简单，但是对于特异性和灵敏度是一个不容小视的挑战。电化学方法相较于其他方法而言，具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、仪器简单的优点，更重要的是，它还可以与微透析设备联用，实现在线实时的检测目标物。目前已发表的文献中，用电化学方法检测谷氨酸的检测限为50μM，但实际的鼠脑内的谷氨酸含量仅有几个μM，即现有的电化学方法不能满足实际的鼠脑中谷氨酸的检测，因此提高电化学方法检测谷氨酸的灵敏度和降低检测限是亟需解决的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种脱氢酶电极及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种脱氢酶电极，包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的催化剂层和涂敷于所述催化剂层上的酶层。其中，所述酶层包括谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶。抗坏血酸氧化酶的引入可使抗坏血酸氧化，成功的避免了实际动物鼠脑中抗坏血酸的干扰影响，使将所述脱氢酶电极应用于活体动物(如鼠)脑中谷氨酸的在线实时检测成为可能。进一步地，所述谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶相对于基底电极的含量分别为0.5-1.0U/mm2，优选0.8U/mm2。进一步地，为了增加酶层的稳定性，可使用交联剂，具体可为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐或双偶氮苯，优选为戊二醛。以戊二醛为例，每平方毫米基底电极上使用质量分数为1-10％的戊二醛溶液0.1-1.0μL。进一步地，所述催化剂层为亚甲基绿或者亚甲基蓝染料液，优选为1mM的亚甲基绿染料液。谷氨酸被谷氨酸脱氢酶氧化产生α-酮戊二酸，同时将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变成还原型的NADH，催化剂亚甲基绿可降低NADH氧化电位，催化NADH在电极上的氧化过程，产生电流信号的变化，以此实现对谷氨酸的电化学检测。所述催化剂层采用本领域常规技术手段滴涂在基底电极上，优选滴涂时间为1h-12h，更优选为2h。进一步地，所述基底电极为活化后的玻碳电极，所述活化步骤具体为：将玻碳电极置于0.1M、pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，在活化电位为-1.6V～+2.7V条件下，活化15～40min。优选活化电位为-1.5V～2.5V，活化时间为20min。所述玻碳电极经上述活化后，能够在电极表面产生多个活化位点，利于催化剂的吸附。基于前述脱氢酶电极的组成，本专利技术提供了所述脱氢酶电极的制备方法，包括如下步骤：1)在基底电极上滴涂催化剂层，制得吸附了催化剂的玻碳电极；2)在吸附了催化剂的玻碳电极上滴涂谷氨酸脱氢酶、抗坏血酸氧化酶和交联剂，于室温下交联后置于4℃固定。第二方面，基于前述脱氢酶电极的优势，本专利技术进一步提供了前述脱氢酶电极在实时检测动物脑中谷氨酸浓度方面的应用。具体为：以pH7.5-9.0(优选pH 8.5)的磷酸缓冲溶液或者人工脑脊液作为底液，绘制电化学传感器工作曲线。绘制电化学传感器工作曲线具体为：将作为参比电极的银/氯化银电极、作为对电极的铂丝电极和本专利技术所述脱氢酶电极连接在电化学工作站上，测定含有不同浓度的谷氨酸的底液对应的电流变化值，并绘制线性曲线。进一步地，所述底液中含有浓度为1～10mM(优选2mM)的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。并在底液中加入浓度为0.5～2*10-5M(优选1.6×10-5M)的稀土金属离子用以提高谷氨酸脱氢酶的活性，所述稀土金属离子为铕和/或镱和/或镧(优选为镱)。需要说明的是，上述工作曲线的线性范围为0～300μM，优选范围为本专利技术的有益效果在于：本专利技术在脱氢酶电极的酶层引入谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶，实现了在线实时的检测目标物并成功避免了其他的干扰。本专利技术进一步调整优化了所述脱氢酶电极的工作环境，提高灵敏度，降低了检测限，使之用于活体中低浓度的谷氨酸检测成为可能。本专利技术的脱氢酶电极在pH 8.5且含有稀土金属离子镱、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+存在的磷酸缓冲溶液中，通过谷氨酸脱氢酶实现了对低浓度的谷氨酸的催化氧化。本专利技术脱氢酶电极的制备方法简易、重现性好、检测限低、灵敏度高，所制备的传感器可用于实际动物鼠脑中谷氨酸的在线实时检测。附图说明图1为实施例1所述脱氢酶电极在不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)的人工脑脊液中，对于100μM谷氨酸的电流响应，采用的是计时电流法。图2为实施例1所述脱氢酶电极在pH 8.5的人工脑脊液中加入不同的稀土金属离子(镧、铕、镱)，对于低浓度的谷氨酸(10μM、20μM、50μM)的电流响应，采用的是计时电流法。图3为实施例1所述脱氢酶电极在pH 8.5的不同的底液(分别为磷酸缓冲溶液(PBS)和人工脑脊液(aCSF))，对于低浓度的谷氨酸(5μM，10μM，20μM，50μM)的电流响应，采用的是计时电流法。图4为实施例1所述脱氢酶电极在加入稀土金属离子镱，pH 8.5的磷酸缓冲溶液中制作的工作曲线，即对于不同浓度(4μM，10μM，20μM，50μM，100μM，每个浓度之间切换空白溶液)的谷氨酸的电流响应。图5为对比例1所述电极在pH为7.5的人工脑脊液中测定100μM谷氨酸对应的电流变化值。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例11)活化：将玻碳电极置于0.1M，pH 7.4磷酸缓冲溶液中采用循环伏安法在活化电位为-1.6V～+2.7V条件下活化20min，制得活化后的玻碳电极；2)吸附：将步骤1)制得的活化后的玻碳电极置于1mM亚甲基绿溶液2h，制得吸附了亚甲基绿催化剂的玻碳电极；3)固定酶：将步骤2)制得的吸附亚甲基绿的玻碳电极滴涂上谷氨酸脱氢酶、抗坏血酸氧化酶和交联剂，于室温下交联后放4℃冰箱固定，制得脱氢酶电极(或可称电化学传感器)。实施例2本实施例与实施例1的区别在于：将亚甲基绿溶液替换为亚甲基蓝溶液。实施例3本实施例与实施例1的区别在于：将步骤2)制得的吸附亚甲基绿的玻碳电极滴涂上谷氨酸脱氢酶、谷丙转氨酶、抗坏血酸氧化酶和交联剂。实验例1利用实施例1所述脱氢酶电极绘制电化学传感器工作曲线。将作为参本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脱氢酶电极，包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的催化剂层和涂敷于所述催化剂层上的酶层，其特征在于，所述酶层包括谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶。
【技术特征摘要】
1.一种脱氢酶电极，包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的催化剂层和涂敷于所述催化剂层上的酶层，其特征在于，所述酶层包括谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶。2.根据权利要求1所述的脱氢酶电极，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶相对于基底电极的含量分别为0.5-1.0U/mm2。3.根据权利要求2所述的脱氢酶电极，其特征在于，所述催化剂层为亚甲基绿或亚甲基蓝。4.根据权利要求1-3任意一项所述的脱氢酶电极，其特征在于，所述基底电极为活化后的玻碳电极，所述活化步骤具体为：将玻碳电极置于0.1M、pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，在活化电位为-1.6V～+2.7V条件下，活化15～40min。5.根据权利要求1所述的脱氢酶电极，其特征在于，所述酶层包括谷氨酸脱氢酶、抗坏血酸氧化酶和交联剂；谷氨酸脱氢酶和抗坏血酸氧化酶相对于基底电极的含量为0.8U/mm2；所述交联剂为质量分数为1-10％的戊二醛溶液，戊二醛溶液相对于基底电极的用量为0.1-1.0μL/mm2；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：林雨青，李博，李琳，赵旭，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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