一种罗汉果外植体表面灭菌方法技术

本发明专利技术提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，属于植物组织培养技术领域，使用本发明专利技术的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养技术，尤其涉及一种罗汉果外植体表面灭菌技术。
技术介绍
罗汉果(学名：Siraitiagrosvenorii)是葫芦科多年生藤本植物。其叶心形，雌雄异株，夏季开花，秋天结果。中医以其果实入药，含有罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等药用成分，主治肺热痰火咳嗽、咽喉炎、扁桃体炎、急性胃炎、便秘等。因为罗汉果是雌雄异株，又花期不遇，加之花粉粘重且着生于花药不易被昆虫触及的地方，所以很难像普通的风媒花或虫媒花那样传粉，因此自然条件下，结果的机率极低(目前人工栽培仍然必须人工授粉)。同时，罗汉果种子实生苗有70％左右为雄株，且要等到2～3年之后，开花时才能判定，生产上基本无实用价值。但是，罗汉果的习性是，到了秋季分枝藤蔓会向下垂，并迅速伸长，一经着地就会膨大变作指头大小的块茎(俗称“薯块”、“薯仔”)，可以顽强地越冬，来年萌发成为独立的新植株。这是罗汉果自然繁殖的重要方式。在人工栽培之后，演化成了人工压蔓，小“块茎”依然是罗汉果最重要的种源。然而，这些传统块茎容易传播病毒及其它病虫害，又难以大批量生产，无法满足现代规模化种植的需求。世纪末无菌无毒的罗汉果组培苗研究成功，很快就取代传统块茎成为最重要的种源。先研究在罗汉果组培技术前，其消毒杀菌下过不
是很理想，导致后面的组织培养成活率不高。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种罗汉果外植体表面灭菌技术。本专利技术通过以下技术方案得以实现。本专利技术提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为3～5％的肥皂水浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.05～0.1％的柠檬酸溶液浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度50～60％的酒精溶液浸泡15～20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.1～0.3％的高锰酸钾溶液浸泡3～5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。进一步的，包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一
次；5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。进一步的，得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10～20s。进一步的，得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.5～0.7mg/L+IAA0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。本专利技术的有益效果在于：使用本专利技术的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。为了证明本专利技术的技术效果，本专利技术还提供以下试验例：试验例一试验组1：其处理步骤为：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。6)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒
MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润试验组2：其处理步骤为：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体；6)得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10～20s；7)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润对照组：其处理步骤为：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)使用无菌水进行处理；检测上述试验的诱导率、污染率和褐化率，具体如下表：结果表明，使用本专利技术的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。具体实施方式下面进一步描述本专利技术的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。实施例一本专利技术提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为3％的肥皂水浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.05％的柠檬酸溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度50～60％的酒精溶液浸泡15s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.1％的高锰酸钾溶液浸泡3min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。6)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。实施例二本专利技术提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为5％的肥皂水浸泡10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.1％的柠檬酸溶液浸泡10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度60％的酒精溶液浸泡20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.3％的高锰酸钾溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。6)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。实施例三本专利技术提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为4％的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.08％的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度55％的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.2％的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体；6)得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10～20s；7)得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.6mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为3～5％的肥皂水浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.05～0.1％的柠檬酸溶液浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度50～60％的酒精溶液浸泡15～20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.1～0.3％的高锰酸钾溶液浸泡3～5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。

【技术特征摘要】
1.一种罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用浓度为3～5％的肥皂水浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；3)再用浓度为0.05～0.1％的柠檬酸溶液浸泡5～10min，捞起后使用无菌水冲洗一次；4)再用浓度50～60％的酒精溶液浸泡15～20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；5)再使用浓度为0.1～0.3％的高锰酸钾溶液浸泡3～5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。2.如权利要求1所述的罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于包括以下步骤：1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；2)用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊连，罗小廷，张俊蛟，
申请(专利权)人：贵州德江易盛农业科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州;52