本发明专利技术公开了一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，该方法基于沸石的亲和选择‑液质谱筛选，通过将乙酰胆碱酯酶吸附到沸石上，对药用植物提取物中的乙酰胆碱酯酶抑制剂进行筛选。本发明专利技术对影响吸附的因素，如:沸石类型、溶液pH值、吸附时间、吸附温度等因素进行了系统优化，并且还对筛选药物的影响因素，如：孵育液pH、孵育液离子强度、孵育液温度、孵育时间等因素进行了系统优化，建立了能高效、正确、灵敏、重复性高的筛选抗阿尔兹海默症成分的方法，具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种药物的筛选方法，具体涉及一种筛选效率高、基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法。
技术介绍
目前，基于亲和选择-质谱的方法在药用植物活性成分筛选中的应用越来越多，该法通过靶标亲和选择，发现混合物中的靶标结合物，然后对结合物进行鉴定，可以大大加快筛选的过程。这些方法包括亲和超滤法、磁珠法、涡流色谱法、亲和细胞膜色谱法等。根据选用靶点存在的状态，可以将这些方法分为两类：溶液化酶和固定化酶。固定化酶的方法可以模拟膜粘连的酶或蛋白真实存在的环境，并且可以快速与筛选对象进行分离(如磁珠法)，但是，并不是所有酶都适合进行固定，有些酶固定之后可能会失去活性。溶液化酶方法需要离心机或泵来施加压力，使溶液通过分离膜。有些化合物可能会吸附分离膜上，从而导致假阳性的结果。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，该方法通过将乙酰胆碱酯酶吸附到沸石上，然后和待筛选的药物共孵育，先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱，最后对变性洗脱物进行液质分析、鉴定。筛选出具有抗阿尔兹海默症的药物。本专利技术提供的方法，筛选效率高，筛选准确度高，灵敏度高，对于新的抗阿尔兹海默症药物的筛选具有重要应用价值。技术方案，为实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为：一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，包括以下步骤：(1)将沸石和靶标蛋白一起混合、孵育，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附靶标蛋白得到吸附靶标蛋白的沸石，然后将未吸附的靶标蛋白分离，得到吸附靶标蛋白的沸石；(2)将步骤(1)得到的吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱；(3)对步骤(2)的变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关信息， 筛选出具有抗阿尔兹海默症作用的药物。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(1)沸石和靶标蛋白孵育条件为：pH值为8.0，孵育温度为25℃，孵育时间为20min。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)所述的变性清洗液为乙腈水溶液或甲醇水溶液。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)孵育结束后先用PBS缓冲液清洗4次，变性清洗液为体积浓度50％的甲醇水溶液。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物在37℃下孵育20min。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的pH值在7.4时进行孵育。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的的离子强度为10mM，pH值在7.4时进行孵育。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，所述的沸石为β型沸石。一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)称取延胡索粉末，加入水中，回流提取，得提取液，过滤，得滤液，离心，吸取上清液，得延胡索提取液，备用；(2)将乙酰胆碱酯酶溶解在PBS缓冲液中，加入沸石，加入PBS缓冲液，搅拌，调节溶液的pH值为8.0，在25℃条件下孵育20min，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附乙酰胆碱酯酶得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石，然后将未吸附的乙酰胆碱酯酶溶液吸除，得到吸附乙酰胆碱酯酶的沸石；(3)将步骤(1)提取得到的延胡索提取液和步骤(2)得到的吸附乙酰胆碱酯酶的沸石混合，加入PBS缓冲液，使离子强度为10mM，pH值为7.4，37℃ 孵育20分钟，离心吸出孵育液，加入PBS缓冲液清洗沸石四次，最后加入体积浓度为50％甲醇水溶液洗脱沸石，吸取50％甲醇水溶液洗脱液，进行液质分析。作为优选方案，以上所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，液质分析条件为：4.6mm×150mm，5μm的Kromasil C18柱，流动相：A相为用甲酸调制pH3.5的10mM醋酸铵溶液，B相为乙腈；梯度洗脱：0min，5％B；5min，15％B；10min，20％B；20min，25％B；30min，100％B；35min，100％B，流速0.6mL·min－1，柱温30℃，进样体积5μL；液质分析参数：正离子模式，毛细管温度325℃，离子源电压+4.5kV，喷雾气压379.21kPa，去簇电压+60V，加热气压379.21kPa，离子源温度550℃，一级质谱扫描范围m/z 100-1500，二级质谱激活类型CID。有益效果：本专利技术提供的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法具有以下优点：本专利技术提供的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法工艺设计合理，通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育时溶液的pH和离子强度和变性清洗液。本专利技术可应用于筛选和评价天然产物以及化学合成药物中阿尔兹海默症治疗作用物质。与传统紫外筛选方法相比，可显著提高筛选效率、缩短筛选时间，并且能够发现化合物之间的协同效应。同时，本专利技术的筛选方法具有快速、准确、重现性好、灵敏度高等特征。附图说明图1为不同类型沸石在不同的孵育时间、pH值及温度下对乙酰胆碱酯酶吸附影响的曲线图。图2为不同清洗次数对沸石上吸附的化合物的清洗情况的柱状图。图3为不同变性洗脱液对吸附在沸石上的乙酰胆碱酯酶清洗情况的柱状图。图4为在不同的pH值、孵育时间、离子强度和温度下乙酰胆碱酯酶对黄连碱溶液吸附情况的柱状图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。以下实施例所用试剂：乙酰胆碱酯酶(sigma，EC3.1.1.7)，乙酰硫代胆碱(sigma)，黄连碱、四氢 非洲防己碱、原阿片碱、别隐品碱、延胡索乙素、黄连碱、紫堇碱、小檗碱、脱氢紫堇碱、非洲防己碱、四氢黄连碱、紫堇灵、去氢海罂粟碱、四氢小檗碱(成都瑞芬思生物科技有限公司)，盐酸巴马汀(上海源叶生物科技有限公司)，沸石(天津市实铅化工有限公司)，加兰他敏(天津美仑生物技术有限公司)。以下实施例所用仪器：AB Sciex 5600液质联用仪器(AB Sciex公司)。实施例1 吸附乙酰胆碱酯酶沸石的制备方法优选1、实验方法： 将5ml配制好的乙酰胆碱酯酶溶液(2mg/ml)，溶解在200mM pH8.0的PBS缓冲液中，将5mg沸石放入缓冲液中，轻轻地搅拌，每隔一定时间取出20μl孵育液，用Bradford法测定孵育液中剩余的蛋白量。分别对影响吸附的3个因素进行考察：首先取不同类型的沸石(Y型，ZSM-5型，Beta型)和一定量的乙酰胆碱酯酶溶液(5mL，2mg/mL)进行孵育，考察不同类型沸石对吸附的影响。其次，考察不同pH值(5.8，6.2，6.8，7.2和8.0)的PBS缓冲液对吸附的影响。第三，考察不同孵育本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将沸石和靶标蛋白一起混合、孵育，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附靶标蛋白得到吸附靶标蛋白的沸石，然后将未吸附的靶标蛋白分离，得到吸附靶标蛋白的沸石；(2)将步骤(1)得到的吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱；(3)对步骤(2)的变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关信息，筛选出具有抗阿尔兹海默症作用的药物。
【技术特征摘要】
1.一种基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将沸石和靶标蛋白一起混合、孵育，应用物理吸附技术在沸石表面上吸附靶标蛋白得到吸附靶标蛋白的沸石，然后将未吸附的靶标蛋白分离，得到吸附靶标蛋白的沸石；(2)将步骤(1)得到的吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱；(3)对步骤(2)的变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关信息，筛选出具有抗阿尔兹海默症作用的药物。2.根据权利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，步骤(1)沸石和靶标蛋白孵育条件为：pH值为8.0，孵育温度为25℃，孵育时间为20min。3.根据权利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述的变性清洗液为乙腈水溶液或甲醇水溶液。4.根据权利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)孵育结束后先用PBS缓冲液清洗4次，变性清洗液为体积浓度50％的甲醇水溶液。5.根据权利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物在37℃下孵育20min。6.根据权利要求1所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的pH值在7.4时进行孵育。7.根据权利要求5所述的基于沸石吸附的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于，步骤(2)将吸附靶标蛋白的沸石和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使溶液的的离子强度为10mM，pH值在7.4时进行孵育。8.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶益，蒋妍慧，李伟东，蔡宝昌，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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