呼吸道合胞病毒抗原组合物和方法技术

本发明专利技术涉及呼吸道合胞病毒抗原组合物和方法，以及包含来自RSV之多肽表位的多层膜。所述多层膜在向宿主施用后能够在宿主体内引起免疫应答。所述多层膜包含至少一种经设计的肽，所述经设计的肽包含一种或更多种来自RSV的多肽表位。特别地，所述多层膜包含两种来自RSV的多肽表位，例如引起特异性T细胞应答如细胞毒性T细胞应答的表位，以及引起特异性抗体应答的表位。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2011年7月7日、申请号为“201180033742.9”、专利技术名称为“呼吸道合胞病毒抗原组合物和方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2011/043136的中国国家阶段申请。相关申请的交叉引用本申请是于2011年5月13日提交的美国临时申请No.61/485669和于2010年7月7日提交的美国临时申请No.61/362029的正式申请，其二者都整体并入本文。
本公开内容涉及用于预防呼吸道合胞病毒感染的组合物和方法，特别是包含抗原表位的多层膜组合物。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是造成全世界婴幼儿严重下呼吸道疾病的最重要原因，也威胁着老年人和免疫缺陷患者。在美国，RSV感染每年导致多至126,000个婴儿住院治疗，以及多至60,000个老年人住院治疗。因为自然RSV感染不诱发持久的长期免疫，所以患者在一生中均可以被相同或不同的病毒株再感染。RSV与继发感染如中耳炎相关，其可使得幼儿在之后易于患哮喘相关疾病。在经过40多年的努力以后，依旧没有安全有效的RSV疫苗。在二十世纪六十年代最早尝试开发出的福尔马林灭活明矾沉淀RSV(formalin-inactivated alum-precipitated RSV，FI-RSV)疫苗实际上表现出易于使被接种的儿童在随后的自然感染中患上更加严重的疾病甚至是死亡。尚未全面表征出该应答的准确机制，但是其似乎依赖于使免疫应答向以细胞因子和趋化因子途径之不恰当活化为特征的炎性Th2优势表型(Th2-dominant phenotype)偏移。考虑到RSV疾病对经济的影响(2004年在美国估计为每年近700百万美元)以及RSV感染婴儿、老人和免疫缺陷患者可造成的威胁生命的并发症，开发安全有效的RSV疫苗极为重要。需要适于刺激针对RSV之免疫应答的改进的抗原组合物。
技术实现思路
在一个实施方案中，组合物包含来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中第一多肽表位和第二多肽表位与一种或更多种聚电解质共价相连，其中所述一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中聚电解质包括分子量大于1,000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，其中来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中。在另一实施方案中，组合物包含来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中第一多肽表位和第二多肽表位为一个或更多个多层膜的形式，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中多层膜的至少一种聚电解质包含经设计的多肽，其中经设计的多肽带有足以与带相反电荷的表面稳定结合的电荷，其中经设计的多肽包含来自RSV的第一多肽表位、来自RSV的第二多肽表位或二者，其中不是经设计的多肽的聚电解质包括分子量大于1,000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，其中来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中。组合物包含与一种或更多种聚电解质共价连接的RSV-G多肽表位，其中所述一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中聚电解质包括分子量大于1,000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料。附图说明图1：完整ACT-2044(SEQ ID NO：8)的MH6+6电荷态的放大FT-ICR质谱图。全氧化肽的预期单同位素m/z＝1015.43，实测值＝1015.6008。该结果与ACT-2044中两个分子内二硫键完全相符。图2：ACT-2086(SEQ ID NO：13)的FT-ICR质谱图。MH9+9单同位素峰的m/z为867.1571，对应于7795.344amu的单同位素质量，其非常接近于7795.33amu的单同位素质量计算值。该结果完全与ACT-2086中两个二硫键的存在符合。图3：在每一ELBL成层步骤后测量的纳米颗粒的表面(ζ)电势。未包被颗粒(EP)具有正ζ值。包被单层PGA得到负ζ值。随后用经设计的肽ACT-2031、多肽PGA和PLL、或经设计的肽ACT-2044进行的成层步骤造成ζ电势交替正或负移，表明成功的ELBL步骤。图4：通过足垫注射用纳米颗粒ACT-1042(SEQ ID NO：8；RSV-G164-191)免疫BALB/c小鼠三次；获取血清并且用ELISA进行测定。血清识别RSV-G CX3C构象表位肽ACT-2044(SEQ ID NO：8)。图5：通过足垫注射用纳米颗粒ACT-1042(SEQ ID NO：8；RSV-G164-191)免疫BALB/c小鼠三次；获取血清并且用ELISA进行测定。血清不识别同一肽通过半胱氨酸残基加帽来线性化的形式(ACT-2054；SEQ ID NO：9)。图6：通过足垫注射用纳米颗粒ACT-1042(SEQ ID NO：8；RSV-G164-191)免疫BALB/c小鼠三次；获取血清并且用ELISA进行测定。血清也识别天然RSV-G蛋白。图7：通过足垫注射用纳米颗粒ACT-1042(SEQ ID NO：8；RSV-G164-191)免疫BALB/c小鼠三次；获取血清并且在测量RSV-G与CX3CR1趋化因子受体结合之抑制的生物化学结合测定中进行检测。由ACT-1042引起的抗体应答的生物活性通过RSV-G与趋化因子受体结合的抑制来确定。图8：通过足垫注射用纳米颗粒ACT-1042(SEQ ID NO：8；RSV-G164-191)免疫BALB/c小鼠三次；获取血清并且在细胞迁移实验中进行测定。由ACT-1042引起的抗体应答的生物活性通过人PBMC向经纯化RSV-G迁移的抑制来确定。图9：通过s.c.、i.p.、i.n.和足垫施用用ACT-1023(SEQ ID NO：12；RSV-M281-98)免疫后的RSV-M2特异性T细胞应答。在免疫后14天从小鼠体内获取脾细胞，在IL-4或IFNγELISPOT板中用RSV-M2肽ACT-2019(SEQ ID NO：7)再刺激。结果显示在单个未处理或免疫动物中每106细胞抗原特异性T细胞的数量。图10：多价RSV纳米颗粒混合疫苗的免疫原性。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠(5只/组，5至6周龄)。针对RSV-G的抗体应答：在第28天采集血清，用ELISA测量RSV-G特异性IgG抗体效价。数据为每组5只小鼠的平均值±SD。图11：多价RSV纳米颗粒混合疫苗的免疫原性。在第0天和第21天免疫BALB/c小鼠(5只/组，5至6周龄)。针对RSV-M2的T细胞应答：在第28天获取脾细胞，在IFNγ或IL-4ELISPOT板中用RSV-M2(ACT-2031；SEQ ID NO：12)再刺激。数据为每组5只小鼠的平均值±SD。图12：通过RSV纳米颗粒免疫诱导体内CTL活性。如所示免疫BALB本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，其包含：来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中至少一种聚电解质是经设计的多肽，以及其中所述聚电解质包括分子量大于1,000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，以及其中所述来自RSV的第一多肽表位和所述来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中，其中所述来自RSV的第一多肽表位由NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNK或NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKT组成且为第一经设计之多肽的形式，其中所述第一经设计的多肽由与一个或更多个第一表面吸附区域共价连接的所述来自RSV的第一多肽表位组成，所述第一表面吸附区域由至少八个氨基酸残基组成，其中所述第一表面吸附区域和所述第一经设计的多肽具有相同的电荷符号，其中所述第一经设计的多肽具有大于或等于0.4的每残基净电荷以及在pH 4至10时大于0.1mg/ml的溶解度，其中所述来自RSV的第二多肽表位由ESYIGSINNITKQSA(SEQ ID NO.7)、ESYIGSINNITKQSASVA或ESYIGSINNITKQSASGS组成且为第二经设计之多肽的形式，其中所述第二经设计的多肽由与一个或更多个第二表面吸附区域共价连接的所述来自RSV的第二多肽表位组成，所述第二表面吸附区域由至少八个氨基酸残基组成，其中所述第二表面吸附区域和所述第二经设计的多肽具有相同的电荷符号，其中所述第二经设计的多肽具有大于或等于0.4的每残基净电荷以及在pH 4至10时大于0.1mg/ml的溶解度，或者其中所述来自RSV的第一多肽表位由NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNK或NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKT组成并且所述来自RSV的第二多肽表位由ESYIGSINNITKQSA(SEQ ID NO.7)、ESYIGSINNITKQSASVA或ESYIGSINNITKQSASGS组成，并且所述来自RSV的第一和第二多肽表位为经设计之多肽的形式，其中所述经设计的多肽由与一个或更多个表面吸附区域共价连接的所述来自RSV的第一和第二多肽表位组成，所述表面吸附区域由至少八个氨基酸残基组成，其中所述表面吸附区域和所述经设计的多肽具有相同的电荷符号，其中所述经设计的多肽具有大于或等于0.4的每残基净电荷以及在pH 4至10时大于0.1mg/ml的溶解度并且其中所述经设计的多肽任选地包含C末端酰胺。...

【技术特征摘要】
2010.07.07 US 61/362,029;2011.05.13 US 61/485,6691.组合物，其包含：来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中一种或更多种聚电解质在一个或更多个多层膜中，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，其中至少一种聚电解质是经设计的多肽，以及其中所述聚电解质包括分子量大于1,000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，以及其中所述来自RSV的第一多肽表位和所述来自RSV的第二多肽表位存在于同一多层膜或不同的多层膜中，其中所述来自RSV的第一多肽表位由NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNK或NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKT组成且为第一经设计之多肽的形式，其中所述第一经设计的多肽由与一个或更多个第一表面吸附区域共价连接的所述来自RSV的第一多肽表位组成，所述第一表面吸附区域由至少八个氨基酸残基组成，其中所述第一表面吸附区域和所述第一经设计的多肽具有相同的电荷符号，其中所述第一经设计的多肽具有大于或等于0.4的每残基净电荷以及在pH 4至10时大于0.1mg/ml的溶解度，其中所述来自RSV的第二多肽表位由ESYIGSINNITKQSA(SEQ ID NO.7)、ESYIGSINNITKQSASVA或ESYIGSINNITKQSASGS组成且为第二经设计之多肽的形式，其中所述第二经设计的多肽由与一个或更多个第二表面吸附区域共价连接的所述来自RSV的第二多肽表位组成，所述第二表面吸附区域由至少八个氨基酸残基组成，其中所述第二表面吸附区域和所述第二经设计的多肽具有相同的电荷符号，其中所述第二经设计的多肽具有大于或等于0.4的每残基净电荷以及在pH 4至10时大于0.1mg/ml的溶解度，或者其中所述来自RSV的第一多肽表位由NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNK或NFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKT组成并且所述来自RSV的第二多肽表位由ESYIGSINNITKQSA(SEQ ID NO.7)、ESYIGSINNITKQSASVA或ESYIGSINNITKQSASGS组成，并且所述来自RSV的第一和第二多肽表位为经设计之多肽的形式，其中所述经设计的多肽由与一个或更多个表面吸附区域共价连接的所述来自RSV的第一和第二多肽表位组成，所述表面吸附区域由至少八个氨基酸残基组成，其中所述表面吸附区域和所述经设计的多肽具有相同的电荷符号，其中所述经设计的多肽具有大于或等于0.4的每残基净电荷以及在pH 4至10时大于0.1mg/ml的溶解度并且其中所述经设计的多肽任选地包含C末端酰胺。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位与所述来自RSV的第二多肽表位存在于单一经设计的多肽中并且在同一多层膜中。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述来自RSV的第一多肽表位与所述来自RSV的第二多肽表位存在于不同的经设计之多肽中。4.根据权利要求3所述的组合物，其中包含所述来自RSV的第一多肽表位的第一经设计的多肽与包含所述来自RSV的第二多肽表位的第二经设计的多肽存在于同一多层膜中。5.根据权利要求3所述的组合物，其中包含所述来自RSV的第一多肽表位的第一经设计之多肽存在于第一多层膜中，以及包含所述来自RSV的第二多肽表位的第二经设计之多肽存在于第二多层膜中。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述膜沉积在核心颗粒上。7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多层膜为中空囊的形式。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层共价交联。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层通过酰胺键共价交联。10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述多层膜的两层或更多层通过二硫键共价交联。11.组合物，其包含：来自RSV的第一多肽表位和来自RSV的第二多肽表位，其中所述第一多肽表位和第二多肽表位为一个或更多个多层膜的形式，其中所述一个或更多个多层膜各包含两层或更多层聚电解质，其中相邻的层包含带相反电荷的聚电解质，并且其中所述多层膜的至少一种聚电解质包含经设计的多肽，其中所述经设计的多肽带有足以与带相反电荷之表面稳定结合的电荷，以及其中所述经设计的多肽包含所述来自RSV的第一多肽表位、所述来自RSV的第二多肽表位或二者，其中不是经设计之多肽的聚电解质包括分子量大于1,000并且每分子至少带5个电荷的聚阳离子材料或聚阴离子材料，以及其中所述来自RSV的第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·J·鲍威尔，詹姆斯·戈勒姆·博伊德，
申请(专利权)人：人工细胞科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US