敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法技术

本发明专利技术公开了一种敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，属于生物技术领域，用40日龄的敖汉细毛羊皮肤作为实验材料，通过对皮肤进行体外培养，将分离出来的毛囊细胞进行生物学特性分析及鉴定，包括形态学观察、冻存、复苏及过程中细胞活力检测、生长动力学分析及生长曲线绘制、核型分析、波形蛋白免疫组化以及微生物污染检测等，以获得活性较高活力较强的细胞，进而建立敖汉细毛羊皮肤毛囊细胞细胞系。细胞活性更好，更利于后续的试验。降低了消化过程中胰蛋白酶的用量，同时缩短了消化时间。同时，细胞冻存保护液采用(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，对细胞冻存保护效果在敖汉细毛羊成纤维细胞上效果更好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，属于生物

技术介绍
随着国内经济的发展，细毛羊产业得到迅速的提升，国内原毛进口量实现飞跃，在当前的环境下，细毛羊的研究更是迫切的到突破，而国内的研究现状大多转为分子方面的研究。细胞培养技术是从1907年开始，在其后的近一个世纪的到飞速的发展，目前可通过不同种的培养细胞进行细胞融合、核移植、及基因转移等的建立。在细胞培养的过程中，细胞培养、生长的状态对于试验的成功及后继试验的研究都起着至关重要的作用，是各项细胞水平研究的前提和基础，由此可见细胞培养及培养出好的细胞系对细胞学、分子细胞学、遗传育种及个体新品种的培育影响甚大。毛囊是控制毛发周期性生长的重要结构，它是一个多层细胞组成的特殊器官，而洗毛衣的羊毛品质及产量都取决于绵羊皮肤组织结构和毛囊性状。但是如何在体外培养中大量获得毛囊隆突部干细胞，且尽量减少其分化，仍是有待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补现有技术的不足，用敖汉细毛羊皮肤作为实验材料，通过对皮肤进行体外培养，将分离出来的毛囊细胞进行生物学特性分析及鉴定，包括形态学观察、冻存、复苏及过程中细胞活力检测、生长动力学分析及生长曲线绘制、核型分析、波形蛋白免疫组化以及微生物污染检测等，以获得活性较高活力较强的细胞，进而建立敖汉细毛羊皮肤毛囊细胞细胞系。本专利技术的技术方案是：敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，包括以下步骤：(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞①取40日龄出生羊采样部位清除羊毛，灭菌，切取含完整组织的皮肤样品，消毒，放入生理盐水中浸泡，然后用PBS(pH＝7.2-7.4)清洗，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品消毒，清洗，后消化，然后放入含有DMEM/F12培养液的培养皿中，取得毛囊置于离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶消化15min，加入3倍体积的工作液终止消化，离心，吸去上清，打碎毛囊，过细胞筛，后
接种，加入培养基中，培养，至细胞涨满90％时进行传代；所述工作液为20％FBS和1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液；③传代培养：吸去培养液，清洗，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，然后加入0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘，间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；(2)细胞冻存与复苏当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记，然后用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h，-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。优选的，步骤(2)所述的4℃预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1。优选的，所述步骤(1)②中取得毛囊的方法为：用眼科剪将经过消化的待分离培养组织样品剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中。优选的，所述方法包括以下步骤：(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞①取40日龄初生羊，肩部采样部位羊毛剪除，75％酒精擦拭灭菌，用提前灭菌的医用剪刀切去肩部皮肤1cm*1cm大小含完整组织的皮肤样品，75％酒精消毒3次，放入生理盐水中浸泡涮洗30S，然后用PBS(pH＝7.2-7.4)清洗2次，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品置于75％酒精中浸泡1min，然后用PBS(pH＝7.2-7.4)溶液清洗5次，置于0.25％胰蛋白酶中37℃消化1h，取出放入含有DMEM/F12培养液的培养皿中，用眼科剪将其剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶37℃消化15min，加入3倍体积的工作液(20％FBS和1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液)终止消化，1500r/min离心5min，吸去上清，将毛囊充分打碎，经150目细胞筛后接种到60mm贴壁培养皿中，加入5ml含1％生长因子(细胞生长因子，也即是T细胞生长因子)的DMEM/F12培养基中，置于37℃，饱和湿度，5％CO2培养相中
培养，细胞涨满90％快会合状态时进行传代；③传代培养：吸去旧培养液，用PBS(pH＝7.2-7.4)洗3次，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，吸去然后加入1ml 0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；(2)细胞冻存与复苏当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液所述预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记。用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h,-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。本专利技术的有益效果是：1所用样品不同在于本试验采用40日龄敖汉细毛羊，品种和样品时间的差异，敖汉细毛羊为本实验室所需，40日龄的的羊所得到的细胞活性更好，并且最大优势在于相比较1-3日龄或者更小的羊来说，40日龄对羊伤害更小，对比更大的羊来说40日龄的羊细胞活力更高，更利于后续的试验。2二次消化中采用胰蛋白酶的浓度为0.1％，消化时间为15分钟，在细胞脱离组织的前提下对细胞的伤害更小。降低了用量，同时缩短了消化时间，对细胞损伤较小。3细胞冻存保护液采用(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1，不容易造成细胞冷冻时产生冰晶破坏细胞，并且保存时间可达十年以上，对细胞冻存保护效果在敖汉细毛羊成纤维细胞上效果更好。附图说明图1为原代细胞生长3d的细胞形态；图2为F2代第3d及F3代第5d的细胞形态；图3左为冻存前细胞流式图，右为复苏后细胞流式图；图4为敖汉细毛羊毛囊细胞细胞的生长曲线；图5细胞核型分析；图6微生物污染检测结果；图7为吉姆萨染色图。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例(各例均为重量％)进一步阐明本专利技术的内
容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本专利技术保护范围的限定。1材料与方法1.1材料1.1.1试验样本来源初生40日龄以内的敖汉细毛羊羊肩部皮肤，来自青岛奥特种羊场。1.1.2试验材料及主要试剂DMEM购自Hyclone；胰蛋白酶、L-Glutamine、标准胎牛血清购自Gibco；DPBS、二甲基亚砜(DMSO)、秋水仙素、0.4％台盼蓝染液、非本文档来自技高网...

【技术保护点】
敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，包括以下步骤：(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞①取40日龄出生羊采样部位清除羊毛，灭菌，切取含完整组织的皮肤样品，消毒，放入生理盐水中浸泡，然后用PBS清洗，迅速放入含有1％的青霉素‑链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品消毒，清洗，后消化，然后放入含有DMEM/F12的培养皿中，取得毛囊置于离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶消化15min，加入3倍体积的工作液终止消化，离心，吸去上清，打碎毛囊，过细胞筛，后接种，加入培养基中，培养，至细胞涨满90％时进行传代；所述工作液为20％FBS和1％的青霉素‑链霉素的DMEM/F12培养液；③传代培养：吸去培养液，清洗，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，然后加入0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘，间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；(2)细胞冻存与复苏当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记，然后用梯度冻存法置于4℃1h，‑20℃2h，‑80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。...

【技术特征摘要】
1.敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，包括以下步骤：(1)分离培养绵羊皮肤毛囊细胞①取40日龄出生羊采样部位清除羊毛，灭菌，切取含完整组织的皮肤样品，消毒，放入生理盐水中浸泡，然后用PBS清洗，迅速放入含有1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液中，置于冰盒中，即为待分离培养组织样品；②将步骤(1)①得到的待分离培养组织样品消毒，清洗，后消化，然后放入含有DMEM/F12的培养皿中，取得毛囊置于离心管中，加入400μL 0.1％的胰蛋白酶消化15min，加入3倍体积的工作液终止消化，离心，吸去上清，打碎毛囊，过细胞筛，后接种，加入培养基中，培养，至细胞涨满90％时进行传代；所述工作液为20％FBS和1％的青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液；③传代培养：吸去培养液，清洗，加入0.1％的胰蛋白酶湿润细胞，然后加入0.1％的胰蛋白酶消化3～7min，当细胞质回缩，细胞边缘，间隙变大后，加入3ml DMEM终止反应，反复吹打皿底，然后按1：2传代到新的培养皿中，隔天换液，待细胞会合再次传代；(2)细胞冻存与复苏当细胞生长到对数生长期时，按照(1)③所述的传代培养步骤制成细胞悬液，离心、去上清，加入4℃预冷的培养液，然后转移到无菌冻存管中，封口，标记，然后用梯度冻存法置于4℃1h，-20℃2h，-80℃12h，然后转入液氮保存，复苏时用37℃温水快速晃动解冻按5*105个/ml接种到新培养皿。2.根据权利要求1所述的敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，步骤(2)所述的4℃预冷的培养液为(80％FBS+20％DMSO)：细胞原液＝4：1。3.根据权利要求1所述的敖汉细毛羊毛囊细胞系建立方法，其特征是，所述步骤(1)②中取得毛囊的方法为：用眼科剪将经过消化的待分离培养组织样品剪成0.5mm的条形，在体式显微镜下用钟表镊将真皮层和皮下组织层从起始部位分离，暴漏出毛囊隆突丛，然后用钟表镊将毛囊从毛囊远端向皮下组织方向拔出，收集获得毛囊置于1.5ml离心管中。4.根据权利要求1-3任一所述的敖汉细...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺建宁，杨峰，赵金山，柳楠，李和刚，巨安庆，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37