本发明专利技术公开了一种2‑苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用。本发明专利技术利用重组酶ARO8、ARO10和ADH1这三种重组酶构成共反应体系，将微生物体内Ehrlich途径需要多步连续反应、多种酶参与才能合成2‑苯乙醇这样复杂的代谢过程，简化为在体外的同一反应体系内进行，从而减少了环境污染、缩短了反应流程。进一步地，本发明专利技术采用戊二醛作为交联剂，将三种重组单酶进行无载体共固定化，制备共交联酶聚集体(Combi‑CLEAs)，体外合成目标产物，从而在上述有益效果的基础上进一步实现酶的循环使用，降低生产成本，本发明专利技术填补了多酶体外制备2‑苯乙醇的技术空白，为生物制备2‑苯乙醇提供重要的借鉴。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物合成
，更具体地，涉及一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用。
技术介绍
2-苯乙醇(2-Phenylethanol,2-PE)又称β-苯乙醇(β-Phenylethanol)，化学名2-苯基乙醇(2-Phenylethyl alcohol,2-PEA)，分子量122.16，结构式为：2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰气味的芳香醇，天然存在于许多植物的精油中，2-苯乙醇香气轻柔甜和，颇受人们欢迎，是目前全球使用量仅次于香兰素的第二大香料成分，广泛应用于食品、化妆品、烟草和日化用品领域，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，而且因其具有协合及增效作用，成为多种香型配方所需的组分，是具有很高价值的香料物质；在医药上，2-苯乙醇是传统的抑菌剂。目前，全球2-苯乙醇的年产量近万吨，基本上都是采用廉价的化工原料苯或苯乙烯化学合成，仅有很少一部分从玫瑰油中提取。化学合成所使用的原料大多对人体健康和环境有巨大危害，而且所合成的产品2-苯乙醇中常含有气味不良、难以除去的杂质，如联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，严重影响产品质量。随着消费观念的改变，人们越来越崇尚“绿色”、“天然”的食品和添加剂。在欧美国家，能被标记为“天然”的调味剂和芳香剂必须是采用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产的。若从玫瑰中提取天然2-苯乙醇，每5t玫瑰鲜花仅能萃取玫瑰精油1kg，生产成本极其昂贵，无法大规模生产。国际上天然2-苯乙醇基本都是以微生物转化L-苯丙氨酸生产，主要集中在法国、德国、日本等发达国家，但生产量远不能满足消费需求。2-苯乙醇的一个重要的生产途径是采用微生物发酵，该途径方法原料和合成过程绿色环保、反应条件温和、产物安全、生产周期短、可大规模生产。微生物菌体内2-苯乙醇的生物合成有三条途径：第一条途径是从头合成的莽草酸途径，广泛存在于微生物体内，但代谢途径长、支路多、存在多种抑制，2-苯乙醇产量极低；第二条是L-苯丙氨酸脱羧生成苯乙胺、去氨基还原生成2-苯乙醇，此途径较少发生；第三条是Ehrlich途径，L-苯丙氨酸通过转氨作用生成苯丙酮酸、再脱羧形成苯乙醛、最后还原生成2-苯乙醇。Ehrlich途径是微生物合成2-苯乙醇的首选途径，是分别在芳香族氨基转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶3种酶的作用下进行的，研究者们已在基因水平上对其进行了深入的研究，重点研究编码3种酶的结构基因及其转录和调控方式。生物界所有物质代谢都由多酶共同作用来完成，这些不同的酶能高度有序地自组装形成多酶复合体(multienzyme complexes，MECs)参与反应，通过提高中间产物在不同酶之间的转运浓度，实现高效催化(Lopez-Gallego et al.,2010；Schoffelen et al.,2012；Zhang,2011)。但是多酶共反应后存在酶分离回收困难、重复利用率低、稳定性较差等问题，也存在2-苯乙醇的产量一直较低，成本增加，香气品质受到影响等较多缺点。目前尚未发现多酶体外制备2-苯乙醇的相关研究和文献报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备技术的不足，拟利用多酶复合体高效催化的这一优点，在体外人工制备多酶反应体系，即将高效表达Ehrlich途径的3种酶3种重组酶置于一个适宜的反应体系中，构建3种重组酶体外共反应制备2-苯乙醇的最优反应体系，不经过生物体内复杂的代谢系统，直接体外制备目标产物2-苯乙醇，建立一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，是在同一反应体系内通过重组转氨酶ⅠARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1组成的共催化体系催化转化，L-苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛，转化为2-苯乙醇；其中，所述反应体系内，是L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:2(U/U/U)配比确定，加入量为100μL，在pH值为5.5～7.5、Mg2+浓度为1.0～5mM的反应体系中，水浴温度为30～40℃条件下，反应转化4～7min后，以等体积的乙腈终止反应，即制得2-苯乙醇。本专利技术创造性地总结得到由重组芳香族转氨酶Ⅰ、苯丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶组成的游离多酶体系，能以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，体外制备2-苯乙醇，具有催化效率高、操作简单、不需提纯中间产物等优点。在所述游离多酶体系条件下，优选L-苯丙氨酸和草酰乙酸地摩尔比为0.75:l。优选ARO8、ARO10和ADH1以1:0.25:1(U/U/U)配比。优选Mg2+浓度为1.0～2.5mM；进一步优选为1.5mM。优选地，水浴温度为33～40℃；进一步优选为37℃，优选在37℃水浴反应5min。优选地，pH值为5.5～6.5；进一步优选地，所述pH值为6。最优选地，在所述游离多酶体系条件下，所述L-苯丙氨酸和草酰乙酸的摩尔比为0.75:l，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1配比，加入量为100μL，pH值6.0、Mg2+浓度为1.5mM，37℃水浴5min后以等体积的乙腈终止反应即得。所述多酶体系在实际应用中还未能完全解决中间体性质不稳定引起的产率不够高、反应后酶分离回收存在一定困难，重复利用率低，稳定性较差等不足，为进一步完善本专利技术技术方案，本专利技术进一步将所述3种重组酶同时固定在同一个载体中，提高酶的稳定性和重复利用率，增加反应的局部浓度以提高产品的得率。在实际研究试验过程中，只有科学确定酶作用的最适温度、最适pH、酶的共固定化比例、固定化次序等各个因素的作用效果和机制以及相互之间影响制约的规律和关系，才能总结出所述3中重组酶的共固定化技术方案。因此本专利技术提供一种优选的技术方案是先将所述重组转氨酶ⅠARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1通过共固定方法制得共催化体系Combi-CLEAs，然后利用Combi-CLEAs对L-苯丙氨酸进行催化转化，经由苯丙酮酸、苯乙醛，转化为2-苯乙醇。在共固定技术方案条件下，其中，所述反应体系内，是以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，优选pH值为5.0、Mg2+浓度为1.0～5mM，水浴温度为40℃，反应转化时间为5min。所述共催化体系Combi-CLEAs的制备方法为：将ARO8、ARO10和ADH1按照1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:1配比后，经沉淀剂硫酸铵沉淀后形成多酶聚集体，加入戊二醛对多酶聚集体进行交联，制得多酶共固定体系；其中，硫酸铵的饱和度为60～90％，pH值为4～6，戊二醛的加入量按照其终浓度为0.05～0.25％(V/V)确定。优选地，沉淀剂硫酸铵的饱和度70％。优选地，沉淀剂硫酸铵的pH值为5优选地，ARO8、ARO10和ADH1的酶配比为1:0.5:1。优选地，所述戊二醛的加入量按照其终浓度为0.1％(V/V)确定。优选地，所述交联的温度为20～35℃，进一步优选30℃。优选地，所述交联的时间为30～150min，进一步优选120min。本专利技术所述Combi-CLEAs具有优良的重复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种2‑苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，是在同一反应体系内通过重组转氨酶Ⅰ ARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1组成的共催化体系催化转化L‑苯丙氨酸，L‑苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛转化为2‑苯乙醇；其中，所述反应体系内，是以L‑苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:2(U/U/U)配比确定，在pH值为5.5～7.5、Mg2+浓度为1.0～5mM的反应体系中，水浴温度为30～40℃条件下，反应转化4～7min后，以等体积的乙腈终止反应，即制得2‑苯乙醇。
【技术特征摘要】
1.一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，是在同一反应体系内通过重组转氨酶Ⅰ ARO8、苯丙酮酸脱羧酶ARO10和醇脱氢酶ADH1组成的共催化体系催化转化L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛转化为2-苯乙醇；其中，所述反应体系内，是以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，重组酶ARO8、ARO10和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:2(U/U/U)配比确定，在pH值为5.5～7.5、Mg2+浓度为1.0～5mM的反应体系中，水浴温度为30～40℃条件下，反应转化4～7min后，以等体积的乙腈终止反应，即制得2-苯乙醇。2.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述L-苯丙氨酸和草酰乙酸的摩尔比为0.75:l。3.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述ARO8、ARO10和ADH1的配比为1:0.25:1。4.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述Mg2+浓度为1.0～2.5mM；优选为1.5mM。5.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述水浴温度为33～40℃；反应时间为5min。6.根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述pH值为5.5～6.5；优...
【专利技术属性】
技术研发人员：林俊芳，郭丽琼，刘晓蓉，云帆，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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