一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，在桃树旺盛生长季节选取茎粗5～15mm一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8～10mm长、5～8mm宽、深及木质部的伤口，继而在伤口内平行切面夹入1～2片蘸有109cfu·mL‑1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，随后用封口膜在刻伤上部缠裹，将刻伤复位。进行自来水喷雾30分钟，制造合适的发病环境。接种后30～90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径、接种位点上、下两端茎粗、计算瘤径比。根据瘤径比划分抗性等级，确定材料的根癌病抗性等级。该方法操作简单，利用刻伤皮层复位提高侵染效率，抗性评价考虑了待鉴定材料的种属及生长状态差异，能够比较准确地评价桃及其近缘种材料对根癌病的抗性等级。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物病害抗性鉴定方法，具体为一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法。
技术介绍
桃及其近缘种植物主要为核果类果树，在生产上其根系常常遭受根癌农杆菌引起的根癌病危害，造成巨大的经济损失。包括野生毛桃、李、杏、扁桃等近缘种果树之间普遍可以相互嫁接，从中筛选抗根癌病的材料作为砧木及砧木育种材料具有重要意义。对于核果类果树根癌病抗性鉴定，在接种方法上目前多通过根部刺伤或划伤后，饱和接种农杆菌溶液，然后在生长季结束后，挖出根系，调查植株根系发病情况，或者通过刺伤枝条茎部，然后注射农杆菌菌液，湿棉球包裹，创造农杆菌侵染条件等，这些方法存在着操作复杂，伤口或针刺深度及接种量难以控制等缺点；在抗性指标评价方面，主要采用瘤径大小或质量、平均瘤径大小等做为病级划分指标或抗性等级的确定，欠缺对接种前植物材料种属差异、植株生长状态差异的考虑，其结果容易受到植物种属、生长状态差异的影响。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，它通过简化接种操作、均一化接种量、制造发病关键期环境条件、采用瘤径生长比作为抗性分级指标，为桃及其近缘种材料的根癌病抗性评价提供了新的方法，可用于亲缘关系相近植物的根癌病抗性鉴定，筛选或评价抗性材料。本专利技术是以如下技术方案实现的：一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，在5～9月份，选取待评价材料茎粗5～15mm一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8～10mm长、5～8mm宽、深及木质部的伤口，在伤口内平行切面夹入1～2片蘸有109 cfu·mL-1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部包裹，将刻伤复位。每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点间距20mm以上。接种对照为蘸有无菌水的滤纸片。接种后3小时内，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，在侵染关键期制造良好环境。接种后30～90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径、接种位点上下两端茎粗、计算瘤径比。根据瘤径比评价材料的根癌病抗性。具体按如下步骤进行：（1）待测材料准备：在田间嫁接或栽培待测试桃及其近缘种材料，如在温室鉴定可栽植在适当容积的花盆中，进行土、肥、水及病虫害防治与管理，利用自然条件或温室光温条件让其快速生长至满足接种条件；（2）根癌农杆菌菌液的培养与标准带菌滤纸片的制备：将农杆菌致病菌株（如AT4-3）接种于YEB液体培养基中，28℃下，200 rpm/min摇床培养约16h，培养好的菌液在5000 rpm/min条件下离心10分钟，用含0.01%吐温20的灭菌蒸馏水重悬，并调整浓度为1×109cfu·mL-1，将直径5mm的灭菌滤纸片呈单片分散放置在培养皿中，在培养皿中倒入农杆菌菌液浸没滤纸片5分钟，然后用胶头吸管弃去多余菌液，盖上培养皿盖备用；（3）农杆菌接种：在5～9月份，选取待评价材料茎粗为5-15mm的一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8～10mm长、5～8mm宽、深及木质部的伤口，在伤口内贴面夹入1～2片蘸有109cfu·ml-1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部包裹将刻伤复位。每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点间距20mm以上，对照为接种蘸有无菌水的滤纸片；（4）接种后喷雾：接种后3小时内，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，提高环境湿度；（5）发病调查：接种后30～90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径（肿瘤加枝条直径）、接种位点上下两端茎粗（平均值为接种点枝条直径）、计算瘤径比（接种点肿瘤加枝条直径与枝条直径比值）；（6）抗性分级与评价：用单一植株最大瘤径比评价植株材料的根癌病抗性；（7）个体分级标准与群体抗性分级：0级，免疫：与对照无明显差异，接种部位突起＜1.0mm，瘤径比（接种后产生的最大冠瘿瘤直径与接种部位枝条直径比值）值为1，接种不发病；1级，高抗：1＜瘤径比≤1.2；2级，中抗：1.2＜瘤径比≤1.5；3级，感病：1.5＜瘤径比≤2；4级，中感：2＜瘤径比≤3；5级，高感：瘤径比＞3。对于群体评价，病情指数的计算如下：病情指数=（∑（各级感病苗数×相应病级）/调查苗总数×5）×100%群体抗性分级如下：免疫，病情指数为0；高抗，0＜病情指数≤20；中抗，20＜病情指数≤40；感病，40＜病情指数≤60；中感，60＜病情指数≤80；高感，病情指数＞80；该专利技术的有益效果为，该鉴定方法操作简单，利用刻伤的皮层将携带根癌农杆菌菌量接近的滤纸圆片贴合在受伤组织部位中间，依靠植物自身伤口愈合过程进行保湿和促进病原的侵染，不易因天气干旱等造成接种失败；抗性评级方法科学，利用瘤径比进行抗性分级，考虑了植物材料因种属差异、生长状态差异引起的评级差异。另外，这种鉴定方法，对田间或室内生长植株都适合。具体实施方式实施举例：桃及其近缘种8个植株个体的根癌病抗性评价（1）待测材料准备：3月初，在温室用营养土作基质，在50L的花盆中栽培实生毛桃、实生山桃、Fa、大久保、绛桃、西藏3号（光核桃）、蒙古扁桃、、新疆野扁桃等8种植株，使其正常生长，并进行日常土肥水及病虫害管理；（2）根癌农杆菌菌液的培养与标准带菌滤纸片的制备：将保存在-20℃冰箱中的甘油与YEB菌液混合的根癌农杆菌致病菌株AT4-3挑取少量，在超净台上接种于装有150ml YEB液体培养基的三角瓶中，28℃下，200 rpm/min摇床培养约16h。培养好的菌液装入离心管在5000 rpm/min条件下离心10分钟，菌体用含0.05%吐温20的灭菌蒸馏水重悬，并调整浓度为1×109cfu·mL-1。将直径5mm的灭菌滤纸片呈单片分散放置在培养皿中，在培养皿中倒入农杆菌菌液浸没滤纸片5分钟，然后用胶头吸管弃去多余菌液，盖上培养皿盖备用；（3）根癌农杆菌接种：在6月初，选取待评价材料茎粗为5-15mm的一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻长8-10mm、宽5-8mm、深及木质部的伤口，在伤口内贴面夹入1片蘸有109cfu/ml AT4-3农杆菌菌液的滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部包裹将刻伤复位。每株接种5个位点。对照为接种蘸有无菌水的滤纸片；（4）接种后叶面喷雾：接种后1小时，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，提高环境湿度；（5）发病调查：接种后60天，用游标卡尺调查不同测试材料各接种部位的最大瘤径（肿瘤加枝条直径）、接种位点上下两端茎粗（平均值为接种点枝条直径）、计算瘤径比（接种点肿瘤加枝条直径与接种点枝条直径比值）；（6）抗性分级与评价：用单一植株最大瘤径比评价植株材料的根癌病抗性；（7）个体分级标准与群体抗性分级：0级，免疫：与对照无明显差异，接种部位突起＜1.0mm，瘤径比（接种后产生的最大冠瘿瘤直径与接种部位枝条直径比值）值为1，接种不发病；1级，高抗：1＜瘤径比≤1.2；2级，中抗：1.2＜瘤径比≤1.5；3级，感病：1.5＜瘤径比≤2；4级，中感：2＜瘤径比≤3；5级，高感：瘤径比＞3。对于群体评价，病情指数的计算如下：病情指数=（∑（各级感病苗数×相应病级）/调查苗总数×5）×100%群体抗性分级如下：免疫，病情指数为0；高抗，0＜病情指数≤20；中抗，20＜病情指数≤40；感病，40＜病情指数≤60本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，其特征在于：选取待评价材料茎粗5～15mm一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8～10mm长、5～8mm宽、深及木质部的伤口，在伤口内平行切面夹入1～2片蘸有109 cfu·mL‑1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部缠裹，将刻伤复位，每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点间距20mm以上，接种对照为蘸有无菌水的滤纸片；接种后3小时内，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，在侵染关键期制造良好环境；接种后30～90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径、接种位点上下两端茎粗、计算瘤径比，根据瘤径比评价材料的根癌病抗性。

【技术特征摘要】
1.一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，其特征在于：选取待评价材料茎粗5～15mm一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8～10mm长、5～8mm宽、深及木质部的伤口，在伤口内平行切面夹入1～2片蘸有109 cfu·mL-1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部缠裹，将刻伤复位，每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点间距20mm以上，接种对照为蘸有无菌水的滤纸片；接种后3小时内，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，在侵染关键期制造良好环境；接种后30～90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径、接种位点上下两端茎粗、计算瘤径比，根据瘤径比评价材料的根癌病抗性。2.根据权利要求1所述的一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，其特征在于：它的具体步骤为：（1）待测材料准备：在田间嫁接或栽培待测试桃及其近缘种材料，如在温室鉴定可栽植在适当容积的花盆中，进行土、肥、水及病虫害防治与管理，利用自然条件或温室光温条件让其快速生长至满足接种条件；（2）根癌农杆菌菌液的培养与标准带菌滤纸片的制备：将农杆菌致病菌株接种于YEB液体培养基中，28℃下，200 rpm/min摇床培养约16h，培养好的菌液在5000 rpm/min条件下离心10分钟，用含0.01%吐温20的灭菌蒸馏水重悬，并调整浓度为1×109cfu·mL-1；将直径5mm的灭菌滤纸片呈单片分散放置在培养皿中，在培养皿中倒入农杆菌菌液浸没滤纸片5分钟，然后用胶头...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新卫，郝峰鸽，王力荣，朱更瑞，方伟超，陈昌文，曹珂，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41