本发明专利技术公开一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法。该试剂盒包含如SEQ ID NO.3～10所示的引物。本发明专利技术的方法采用前述试剂盒实现：以待检测样品的基因组DNA为模板，以正向外引物和反向外引物为引物对进行第一次PCR扩增，得到的PCR产物为模板，以正向内引物和反向内引物为引物对进行第二次PCR扩增，得到的PCR产物进行检测；当使用SEQ ID NO.3～6所示的引物，扩增得到435bp条带，表明待检测样品中存在瘤菌根菌；当使用SEQ ID NO.7～10所示的引物，扩增得到195bp条带，表明待检测样品中存在矮伞形霉。本发明专利技术适用于检测栽培条件下的瘤菌根菌及矮伞形霉，特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物的分子检测
，具体涉及一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒及方法。
技术介绍
兰科(Orchidaceae)植物是显花植物中最大且种类最多的家族之一。在自然条件下，兰科菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi，OMF)对大多数陆生兰花的种子萌发以及植株生长是必不可少的。大花蕙兰是由兰科多个种类杂交形成的品种群，也是目前广泛种植的重要盆栽花卉和鲜切花，但较长的营养生长周期限制了其产品质量及经济效益。前期研究表明，OMF瘤菌根菌(Epulorhiza repens)及MAF矮伞形霉(Umbelopsis nana)在瓶内和盆栽条件下单独或者混合接种大花蕙兰组培苗均可以促进其多个品种的营养生长和矿质营养元素吸收。但原接种菌株是否能在盆栽大花蕙兰根部长期定殖和共存并不清楚。由于土壤环境中其它微生物的存在以及混合接种处理等原因，常规的菌根整体染色、菌株重分离和石蜡切片等技术手段都不再适用于盆栽条件下对目标接种真菌菌株的检测。因此建立一种快速、准确有效且灵敏度高的检测方法是非常有必要的。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。若第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此巢氏PCR技术具有很高的特异性。目前此项技术在鉴定和检测各种微生物的研究上应用极为广泛。但目前尚未有通过巢式PCR检测大花蕙兰菌根真菌瘤菌根菌和/或其伴生真菌矮伞形霉的研究与报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的方
法，是采用上述试剂盒实现的。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，包含用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对和用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对；用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：正向外引物M6F：5'-ACGACGATGAAGATGTGATG-3'；反向外引物M6R：5'-GGAGGTGATACAGTGGGTG-3'；正向内引物M6CF：5'-ATGAAGATGTGATGAGAAGCA-3'；反向内引物M6CR：5'-ATTGGGATAAGGCAGAAGTAG-3'；用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：正向外引物Z3F：5'-TCCTCCTCGTCCTGATTCCG-3'；反向外引物Z3R：5'-ATGTTTTCCCACCAGTAGCC-3'；正向内引物Z3CF：5'-TCAAGTCATTCCCGAACACAA-3；反向内引物Z3CR：5'-GTAGACAAACCAGGAGCCAGC-3'。所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，还包括酶、PCR反应缓冲液和PCR反应用水中的至少一种。一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的方法，包括如下步骤：(1)提取待检测样品的基因组DNA；(2)用上述试剂盒进行检测：先以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以正向外引物和反向外引物为引物对进行第一次PCR扩增，得到的PCR产物；再以此PCR产物为模板，以正向内引物和反向内引物为引物对进行第二次PCR扩增，得到的PCR产物进行凝胶电泳；(3)结果判断：第一次PCR的引物对为正向外引物M6F和反向外引物M6R，第二次PCR的引物对为正向内引物M6CF和反向内引物M6CR，扩增得到435bp条带，表明待检测样品中存在瘤菌根菌；第一次PCR的引物对为正向外引物Z3F和反向外引物Z3R，第二次PCR的引物对为正向内引物Z3CF和反向内引物Z3CR，扩增得到195bp条带，表明待检测样品中存在矮伞形霉。所述的待检测样品为各种栽培条件下的大花蕙兰根部、培养大花蕙兰的土壤或菌株样品。步骤(2)中所述第一次PCR扩增的体系优选为：2×Taq PCR Premix 10μL，浓度为10μmol/L的正向外引物和浓度为10μmol/L的反向外引物各1μL，基因组DNA 200ng，ddH2O补足至20μL。所述的2×Taq PCR Premix优选为GenStar 2×Taq PCR Premix。所述第一次PCR扩增的反应条件优选为：预变性94～95℃5min；变性94℃30s、退火55～60℃20～45s、延伸72℃1min～2min，30个循环；终延伸72℃10min。所述的预变性的温度优选为94℃。所述的退火的条件优选为56～57℃退火30s。所述的延伸的时间优选为1min 30s。步骤(2)中所述第二次PCR扩增的体系优选为：2×Taq PCR Premix 10μL，浓度为10μmol/L的正向内引物和浓度为10μmol/L的反向内引物各1μL，第一次PCR扩增得到的PCR产物稀释20～1000倍1μL，ddH2O补足至20μL。所述第二次PCR扩增的反应条件优选为：预变性94～95℃5min；变性94℃30s、退火56～64℃20～45s、延伸72℃1min～2min，运行15个循环；终延伸72℃10min。所述的预变性的温度优选为94℃。所述退火的温度优选为56～60℃；更优选为56℃。所述的退火的时间优选为30s。所述的延伸的时间优选为1min 30s。步骤(3)中所述的凝胶电泳优选为琼脂糖凝胶电泳。为了评价本专利技术的瘤菌根菌及矮伞形霉的巢式PCR检测在实际应用中的效果，以接种瘤菌根菌、矮伞形霉及多种其它益生菌种类的组培或者盆栽大花蕙兰植株进行巢式PCR检测。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本专利技术方法适用于检测栽培条件下的兰花菌根真菌种类瘤菌根菌及伴生真菌种类矮伞形霉。该方法特异性强、易于操作，对于开发利用生物菌剂促进大花蕙兰生产栽培有十分重要的意义。1.特异性强：本专利技术检测方法是利用两种真菌的特有序列设计的特异巢式PCR引物对进行的菌种检测。已经对来自多种益生真菌混合接种下及不同栽培条件的大花蕙兰根系中的两种真菌进行验证，结果具有很强的特异性。2.实用性好：本专利技术所设计出的两组特异性引物对，可用于对两种菌种的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对菌根化植株中存在的有益菌株种类进行快速可靠的检测和鉴定的需要。3.操作简便快速：应用本专利技术方法，对植株进行DNA提取、PCR扩增和
常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，检测过程只需数小时。附图说明图1是引物M6F/M6R和Z3F/Z3R扩增产物的1.0％琼脂凝胶电泳图；其中，泳道M为DL 2000 DNA Marker；泳道A的模板为矮伞形霉纯培养的DNA，引物为M6F/M6R；泳道B的模板为矮伞形霉纯培养的DNA，引物为Z3F/Z3R；泳道C的模板为瘤菌根菌纯培养的DNA、引物为M6F/M6R；泳道D的模板为瘤菌根菌纯培养的DNA，引物为Z3F/Z3R。图2是引物M6F/M6R特异性分析的1.0％琼脂凝胶电泳图；其中，泳道M为DL2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，其特征在于：包含用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对和用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对；用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：正向外引物M6F：5'‑ACGACGATGAAGATGTGATG‑3'；反向外引物M6R：5'‑GGAGGTGATACAGTGGGTG‑3'；正向内引物M6CF：5'‑ATGAAGATGTGATGAGAAGCA‑3'；反向内引物M6CR：5'‑ATTGGGATAAGGCAGAAGTAG‑3'；用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：正向外引物Z3F：5'‑TCCTCCTCGTCCTGATTCCG‑3'；反向外引物Z3R：5'‑ATGTTTTCCCACCAGTAGCC‑3'；正向内引物Z3CF：5'‑TCAAGTCATTCCCGAACACAA‑3；反向内引物Z3CR：5'‑GTAGACAAACCAGGAGCCAGC‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，其特征在于：包含用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对和用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对；用于检测大花蕙兰瘤菌根菌的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：正向外引物M6F：5'-ACGACGATGAAGATGTGATG-3'；反向外引物M6R：5'-GGAGGTGATACAGTGGGTG-3'；正向内引物M6CF：5'-ATGAAGATGTGATGAGAAGCA-3'；反向内引物M6CR：5'-ATTGGGATAAGGCAGAAGTAG-3'；用于检测矮伞形霉的巢式PCR引物对的核苷酸序列如下：正向外引物Z3F：5'-TCCTCCTCGTCCTGATTCCG-3'；反向外引物Z3R：5'-ATGTTTTCCCACCAGTAGCC-3'；正向内引物Z3CF：5'-TCAAGTCATTCCCGAACACAA-3；反向内引物Z3CR：5'-GTAGACAAACCAGGAGCCAGC-3'。2.根据权利要求1所述检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的试剂盒，其特征在于：还包括酶、PCR反应缓冲液和PCR反应用水中的至少一种。3.一种检测大花蕙兰瘤菌根菌和/或矮伞形霉的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取待检测样品的基因组DNA；(2)用权利要求1或2所述的试剂盒进行检测：先以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，以正向外引物和反向外引物为引物对进行第一次PCR扩增，得到的PCR产物；再以此PCR产物为模板，以正向内引物和反向内引物为引物对进行第二次PCR扩增，得到的PCR产物进行凝胶电泳；(3)结果判断：第一次PCR的引物对为正向外引物M6F和反向外引物M6R，第二次PCR的引物对为正向内引物M6CF和反向内引物M6CR，扩增得到435bp条带，表明待检测样品中存在瘤菌根菌；第一次PCR的引物对为正向外引物Z3F和反向外引物Z3R，第二次PCR的引物对为正向内引物Z3CF和反向内引物Z3CR，扩增得到195bp条带，表明待检测样品中存...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵小兰，刘敏，邓丹丹，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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