拮抗性抗犬PD-1抗体制造技术

本发明专利技术公开了针对犬PD‑1的抗体，其具有特定序列和对犬PD‑1的高结合亲和力。本发明专利技术也公开了本发明专利技术的抗体在治疗狗癌症中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,946、2013年12月20日提交的美国临时申请系列号61/918,847和2014年7月30日提交的美国临时申请系列号62/030,812的权益，它们全部的内容特此通过引用以它们的整体并入。
本专利技术涉及针对犬PD-1的鼠抗体，其具有特定序列和对犬PD-1的高结合亲和力。本专利技术也涉及本专利技术的抗体在治疗狗癌症中的用途。
技术介绍
主要在活化的T和B细胞上表达的免疫抑制性受体（程序性细胞死亡受体1，也被称作程序性死亡受体1（PD-1））是与CD28和CTLA-4有关的免疫球蛋白超家族的一个成员。PD-1和类似的家族成员是含有细胞外Ig可变型（V-型）结构域（其结合它的配体）和胞质尾区（其结合信号传递分子）的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号传递基序：ITIM（基于免疫受体酪氨酸的抑制基序）和ITSM（基于免疫受体酪氨酸的转换基序）。PD-1当结合至程序性细胞死亡配体1（也被称作程序性死亡配体1（PD-L1））和/或程序性细胞死亡配体2（也被称作程序性死亡配体2（PD-L2））时减弱T-细胞应答。这些配体中的任一种与PD-1的结合会负调节抗原受体信号传递。阻断PD-L1与PD-1的结合会增强肿瘤特异性的CD8+ T-细胞免疫，同时辅助免疫系统对肿瘤细胞的清除。已经报道了鼠PD-1的三维结构、以及小鼠PD-1与人PD-L1的共晶结构[Zhang等人,Immunity 20: 337-347 (2004); Lin等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-3016 (2008)]。PD-L1和PD-L2是含有在细胞外区域中的IgV-和IgC-样结构域以及不具有已知信号传递基序的短细胞质区域的I型跨膜配体。PD-L1和PD-L2二者组成性地表达，或者可以在多种细胞类型（包括非造血组织以及多种肿瘤类型）中诱导。PD-L1不仅在B、T、骨髓和树突细胞(DC)上表达，而且在周围细胞（诸如微血管内皮细胞和非淋巴样器官例如心脏或肺）上表达。相反，PD-L2仅存在于巨噬细胞和DC上。PD-1配体的表达模式提示，PD-1在维持外周耐受中起作用，并且还可以用于调节外周中的自体反应性T-和B-细胞应答。在任何情况下，现在非常清楚的是，PD-1在至少某些人癌症中起关键作用，可能是通过介导免疫逃避。因此，PD-L1已经被证实在许多小鼠和人肿瘤上表达，且在大多数PD-L1阴性的肿瘤细胞系中可被IFNγ诱导[Iwai等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)；Strome等人, Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003)]。此外，已经在许多原发性人肿瘤活组织检查中鉴别出PD-1在肿瘤浸润性淋巴细胞上的表达和/或PD-L1在肿瘤细胞上的表达。这样的肿瘤组织包括肺、肝、卵巢、子宫颈、皮肤、结肠、神经胶质瘤、膀胱、乳房、肾、食管、胃、口腔鳞状细胞、泌尿道上皮细胞和胰腺的癌症以及头和颈的肿瘤[Brown等人, J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong等人,Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterle等人,Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome等人,Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003); Thompson等人,Cancer Res. 66: 3381-5 (2006); Thompson等人,Clin. Cancer Res. 13: 1757-1761 (2007); Nomi等人,Clin.Cancer Res. 13: 2151-2157. (2007)]。更惊人的是，在肿瘤细胞上的PD-配体表达已经与跨多个肿瘤类型的人癌症患者的不良预后相关联[综述在Okazaki和Honjo, Int. Immunol. 19: 813-824 (2007)]。此外，Nomi等人[Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007)]证实了通过施用PD-1或PD-L1指导的抗体在侵袭性胰腺癌的鼠模型中阻断PD-L1与PD-1的结合的治疗效果。这些抗体会有效地促进肿瘤反应性的CD8+ T细胞向肿瘤中的渗透，从而导致抗肿瘤效应物（包括IFNγ、颗粒蛋白酶B和穿孔蛋白）的上调。类似地，抗体用于阻断PD-L1和PD-1的结合的用途，会在小鼠鳞状细胞癌模型中显著地抑制肿瘤生长[Tsushima等人,Oral Oncol.42: 268-274 (2006)]。在其它研究中，用PD-L1对鼠肥大细胞瘤系的转染导致当与肿瘤特异性的CTL克隆共培养时减少的肿瘤细胞裂解。当加入抗-PD-L1单克隆抗体时，裂解被恢复[Iwai等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]。在体内，显示了阻断PD1/PD-L1相互作用会增加继承性T细胞转移疗法在小鼠肿瘤模型中的效力[Strome等人, Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)]。关于PD-1在癌症治疗中的作用的其它证据来自用PD-1敲除的小鼠执行的实验，其中表达PD-L1的骨髓瘤细胞仅在野生型动物中生长(导致肿瘤生长和有关的动物死亡)，但是不在PD-1缺陷型小鼠中生长[Iwai Y. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]。近年来，针对PD-1的抗体(包括针对人PD-1的人源化鼠单克隆抗体)已经至少在人类的癌症治疗中显示了初步成功[参见例如，US 8,354,509 B2、US 8,008,449 B2和US 7,595,048 B2]。抗-PD-1抗体还可以用在慢性病毒感染中。在急性病毒感染以后产生的记忆性CD8+ T细胞是高度功能性的，并且构成保护性免疫的一个重要组分。相反，慢性感染经常特征在于病毒特异性的T-细胞应答的不同程度的功能缺损(耗竭)，并且该缺陷是宿主不能消除持久病原体的一个主要原因。尽管功能性的效应T细胞最初在感染的早期阶段产生，它们在慢性感染的进程中逐渐丧失功能。Barber等人[Nature 439: 682-687 (2006)]证实，用LCMV的实验室毒株感染的小鼠发展了慢性感染，导致血液和其它组织中的高病毒水平。这些小鼠最初形成了稳健的T细胞应答，但是最终在T细胞耗竭后屈服于感染。Barber等人发现，通过注射阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用的抗体，可以反转慢性感染的小鼠中效应T细胞的数目和功能的下降。本文中对任何参考文献的引用不应解释为承认：这样的参考文献可作为本申请的“
技术介绍
”得到。
技术实现思路
本专利技术涉及抗-犬PD-1抗体，其具有对犬PD-1的高结合亲和力以及具有阻断犬PD-1与犬PD-L1的结合的能力。在具体实施方案中，这样的抗-犬PD-1抗体是鼠抗-犬PD-1抗体。在具体实施方案中，所述抗-犬P本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD‑1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、包含规范结构类别3的SEQ ID NO: 13的变体、SEQ ID NO: 15或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO: 15的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21的变体；(c) 其中CDRL3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26的变体；(d) 其中CDRH1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30的变体；(e) 其中CDRH2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35的变体；(f) 其中CDRH3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 36、包含规范结构类别6的SEQ ID NO: 36的变体；SEQ ID NO: 38、包含规范结构类别11的SEQ ID NO: 38的变体、SEQ ID NO: 114和包含规范结构类别11的SEQ ID NO: 114的变体；且其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD‑1并阻断犬PD‑1与犬程序性死亡配体1 (PD‑L1)的结合。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 US 61/918,946;2013.12.20 US 61/918,847;1.分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD-1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、包含规范结构类别3的SEQ ID NO: 13的变体、SEQ ID NO: 15或包含规范结构类别2A的SEQ ID NO: 15的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21的变体；(c) 其中CDRL3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26的变体；(d) 其中CDRH1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30的变体；(e) 其中CDRH2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35，或包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35的变体；(f) 其中CDRH3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 36、包含规范结构类别6的SEQ ID NO: 36的变体；SEQ ID NO: 38、包含规范结构类别11的SEQ ID NO: 38的变体、SEQ ID NO: 114和包含规范结构类别11的SEQ ID NO: 114的变体；且其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬程序性死亡配体1 (PD-L1)的结合。2.分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD-1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 13的保守修饰的变体和包含规范结构类别3的SEQ ID NO: 13的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 16的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 16的变体；(c) 其中CDRL3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 22的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 22的变体；(d) 其中CDRH1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 27的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 27的变体；(e) 其中CDRH2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 31的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 31的变体；(f) 其中CDRH3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 36的保守修饰的变体和包含规范结构类别6的SEQ ID NO: 36的变体；且其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬程序性死亡配体1 (PD-L1)的结合。3.分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD-1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 13的保守修饰的变体和包含规范结构类别3的SEQ ID NO: 13的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 19的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 19的变体；(c) 其中CDRL3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 25的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 25的变体；(d) 其中CDRH1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 27的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 27的变体；(e) 其中CDRH2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 31的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 31的变体；(f) 其中CDRH3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 36的保守修饰的变体和包含规范结构类别6的SEQ ID NO: 36的变体；且其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬程序性死亡配体1 (PD-L1)的结合。4.分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD-1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 13的保守修饰的变体和包含规范结构类别3的SEQ ID NO: 13的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 20的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 20的变体；(c) 其中CDRL3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 25的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 25的变体；(d) 其中CDRH1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 27的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 27的变体；(e) 其中CDRH2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 34的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 34的变体；(f) 其中CDRH3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 36的保守修饰的变体和包含规范结构类别6的SEQ ID NO: 36的变体；且其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬程序性死亡配体1 (PD-L1)的结合。5.分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD-1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 13的保守修饰的变体和包含规范结构类别3的SEQ ID NO: 13的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 16的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 16的变体；(c) 其中CDRL3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 22的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 22的变体；(d) 其中CDRH1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 30的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 30的变体；(e) 其中CDRH2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 31的保守修饰的变体和包含规范结构类别1的SEQ ID NO: 31的变体；(f) 其中CDRH3包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 36的保守修饰的变体和包含规范结构类别6的SEQ ID NO: 36的变体；且其中所述抗体和其抗原结合片段结合犬PD-1并阻断犬PD-1与犬程序性死亡配体1 (PD-L1)的结合。6.分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合犬程序性死亡受体1 (犬PD-1)，其包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻1 (CDRL1)、CDR轻2 (CDRL2)和CDR轻3 (CDRL3)；和三个重链CDR：CDR重1 (CDRH1)、CDR重2 (CDRH2)和CDR重3 (CDRH3)：(a) 其中CDRL1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 15的保守修饰的变体和包含规范结构类别2A的SEQ ID NO: 15的变体；(b) 其中CDRL2包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 18的保守修饰的变体和包含规范结...

【专利技术属性】
技术研发人员：M莫塞，张远征，D巴特斯莫罗佐夫，J埃斯基内，I塔佩伊，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL