一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用技术

本发明专利技术公开了一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用。所述的试剂盒包括包被羊抗兔IgG的酶标板、抗氟喹诺酮类药物特异性抗体、氟喹诺酮类药物酶标半抗原、封闭液、洗涤液、底物液、终止液、氟喹诺酮类药物标准溶液。所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。同时，本发明专利技术采用同样的方法合成诺氟沙星和辣根过氧化物酶的偶联物(NOR‑HRP)，并结合多抗以及羊抗兔IgG，建立以羊抗兔IgG—多抗—NOR‑HRP和氟喹诺酮类药物竞争ELISA的模式，实现对氟喹诺酮类药物的多残留检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用，属于酶联免疫分析

技术介绍
氟喹诺酮类药物(FQs)是一类具有6-氟-7-哌嗪-4-诺酮环结构(母核结构)的杀菌性抗菌药物，包括诺氟沙星(NOR)、环丙沙星、恩诺沙星、培氟沙星等，具有抗菌谱广，杀菌力强的优点，尤其是对革兰阴性杆菌具有很高的抗菌活性；另外，氟喹诺酮类药物还具有吸收快、体内分布广泛的优点，可治疗各个系统的感染性疾病。但是，随着氟喹诺酮类药物的滥用，氟喹诺酮类药物的残留已经严重危害到人体健康。2002年，我国规定了环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等氟喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量(MRL)为10-500μg/kg。目前，检测FQs残留的常用方法有色谱检测法和免疫学检测法。色谱检测方法需要昂贵的仪器和专门的工作人员，而且样品处理较烦琐，其应用受到一定的局限，尤其在基层大规模筛选和现场检测中的问题更加突出。免疫学检测方法灵敏、特异、快速、简便，克服了以上的不足，适合大规模筛选。姜金庆等报道的文献，采用碳二亚胺二步法合成环丙沙星人工抗原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，建立了检测环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和培氟沙星4种氟喹诺酮类药物多残留的间接竞争ELISA。(姜金庆，杨雪峰，王自良.氟喹诺酮类药物多残留间接竞争ELI SA检测方法的建立.中国预防兽医学报,2011,33(11)：887-892.)。郑晓冬的专利技术专利(CN103592167A)公开了一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。其选取氟喹诺酮类药物中的六种药物，利用半抗原的羧基与载体蛋白合成免疫抗原，其中环丙沙星，氧氟沙星，恩诺沙星的合成采用的是活性酯法，氟甲喹，达氟沙星，诺氟沙星采用的是氯甲酸异丁酯法。然后混和六种免疫抗原免疫兔子，再经过杂交瘤技术，得到抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体。单抗对恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星等氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果。但是，从目前的文献报道来看，还没有对十种以上的氟喹诺酮类药物具有很好检测效果的试剂盒，因此从试剂盒的广谱度上进行完善，使试剂盒能够满足氟喹诺酮类药物多残留的检测具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原、制备方法、酶标抗原、竞争ELISA试剂盒及应用，该人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原(NOR-BSA)。通过该抗原制备的抗氟喹诺酮类多抗对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星等10种氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原的制备方法，包括如下步骤：(1)将6.6mg BSA和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到A液；(2)将3.6mg诺氟沙星溶解于200μl DMF，得到B液；(3)将B液加入A液中，室温避光磁力搅拌过夜，用pH7.2PBS透析3天，每天换液3次，收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，﹣20℃保存备用。一种氟喹诺酮类药物酶标半抗原，所述的氟喹诺酮类药物酶标半抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)将4mg HRP和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到C液；(2)将3.6mg诺氟沙星溶解于200μl DMF，得到D液；(3)将D液加入C液中，室温避光磁力搅拌过夜，用pH7.2PBS透析3天，每天换液3次，收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，﹣20℃保存备用。一种检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，所述的试剂盒包括包被羊抗兔IgG的酶标板、抗氟喹诺酮类药物特异性抗体、氟喹诺酮类药物酶标半抗原、封闭液、洗涤液、底物液、终止液、氟喹诺酮类药物标准溶液。所述的抗氟喹诺酮类药物特异性抗体为抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体。所述的抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将氟喹诺酮类药物人工免疫抗原免疫新西兰白兔，每组3只，免疫剂量为每次500μg/只，背部皮下分点注射：首免，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FCA混合乳化；加强免疫，用PBS溶解氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，与等量FIA混合乳化；首免后15天进行，共免8次，每次间隔15天，最后一次免疫后10天兔耳缘静脉采血，分离血清，饱
和硫酸铵盐析法纯化抗氟喹诺酮类的多克隆抗体，-20℃冻存备用。所述的试剂盒还包括阴性对照和包被液。所述的洗涤液为PBST洗涤缓冲液，即含质量分数0.05％的Tween-20的0.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液；封闭液为含质量分数5％猪血清的PBST；底物液为含TMB的底物溶液；包被液为0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液；终止液为2mol/L H2SO4。所述的氟喹诺酮类药物包括诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星。一种检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒在检测氟喹诺酮类药物残留方面的应用。本专利技术的有益效果1、本专利技术采用碳二亚胺一步法将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原(NOR-BSA)。同时，本专利技术利用该抗原免疫新西兰白兔制备抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体，实验证明，本专利技术的抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星等10种氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果。2、本专利技术采用同制备人工免疫抗原的方法合成诺氟沙星和辣根过氧化物酶的偶联物(NOR-HRP)，并结合多抗以及羊抗兔IgG，建立以羊抗兔IgG—多抗—NOR-HRP和氟喹诺酮类药物竞争ELISA的模式，实现对氟喹诺酮类药物的多残留检测。3、本专利技术的试剂盒具有成本低、效率高、简单、快速、灵敏，可以同时实现10种氟喹诺酮类药物的残留检测，并且检测限低，符合国家的检测要求。实验证明，本专利技术的试剂盒的检出限为0.2μg/L，多抗对诺氟沙星的半数抑制浓度IC50为2.1μg/L，竞争ELISA的线性检测范围为0.2～107.2μg/L。附图说明图1为抗氟喹诺酮类药物的多克隆抗体对诺氟沙星的抑制曲线。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。实施例1 氟喹诺酮类药物人工免疫抗原的制备本专利技术氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原(NOR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，其特征在于，所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。

【技术特征摘要】
1.一种氟喹诺酮类药物人工免疫抗原，其特征在于，所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原是采用碳二亚胺一步法，将牛血清白蛋白的羧基与诺氟沙星7位哌嗪环上的氨基偶联，使诺氟沙星的母环结构充分暴露，制得具有母环结构的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原。2.一种如权利要求1所述的氟喹诺酮类药物人工免疫抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将6.6mg BSA和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到A液；(2)将3.6mg诺氟沙星溶解于200μl DMF，得到B液；(3)将B液加入A液中，室温避光磁力搅拌过夜，用pH7.2PBS透析3天，每天换液3次，收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，﹣20℃保存备用。3.一种氟喹诺酮类药物酶标半抗原，其特征在于，所述的氟喹诺酮类药物酶标半抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)将4mg HRP和3mg EDC溶于2ml超纯水中，得到C液；(2)将3.6mg诺氟沙星溶解于200μl DMF，得到D液；(3)将D液加入C液中，室温避光磁力搅拌过夜，用pH7.2PBS透析3天，每天换液3次，收集透析液，3000r/min离心5min，收集上清液，真空冷冻干燥，﹣20℃保存备用。4.一种检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括包被羊抗兔IgG的酶标板、抗氟喹诺酮类药物特异性抗体、氟喹诺酮类药物酶标半抗原、封闭液、洗涤液、底物液、终止液、氟喹诺酮类药物标准溶液。5.根据权利要求4所述的检测氟喹诺酮类药物残留的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的抗氟喹诺酮类药物特异性抗体为抗氟...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵银丽，苏兰利，王金荣，赵红月，刘珍，黄进，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41