本发明专利技术公开了一种c‑Met特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗c‑Met单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。本发明专利技术还公开了上述c‑Met特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于c‑Met基因表达相关肿瘤的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞免疫
，尤其涉及一种c-Met特异性嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
肝癌是威胁人类健康的的恶性肿瘤之一，其中大多数为肝细胞癌(hepatocellμLar carcinoma，HCC)。由于缺乏有效的治疗手段，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。在中国，由于存在严重的乙型肝炎病毒(HBV)感染，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻。如今随着分子生物学技术及基因工程技术的发展，肝癌的开辟了新的领域。细胞治疗成为继手术治疗、放疗、化疗后的又一新型模式，并展示出良好的前景。其中靶向治疗是针对明确的靶点，设计出相应的药物，药物进入体内，与靶点结合而发挥特异性作用，因而具有毒副作用低，效率高的优点。肝癌一个有前途的候选靶点是c-met(mesenchymal epithelial transition factor)。c-met为肝细胞生长因子受体，具有络氨酸激酶活性，通常表达于多种组织的上皮细胞。c-met在细胞的代谢、分化以及死亡细胞的信号传导过程中起着重要的作用，当c-met和其高亲和力的配体肝细胞生长因子结合，可活化其信号通路，参与胚胎发育、组织损伤修复以及肿瘤的发生和发展。因而，以酪氨酸激酶受体c-met为靶点的抗肿瘤药物已经成为肿瘤研究中非常火热的领域，为人类对抗肿瘤提供了新的路径。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)主要由三部分构成：胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区。其中胞外抗原结合区通常是由针对肿
瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)的单克隆抗体的单链可变区序列(single chain fragment variable，scFv)构成(轻和重链可变区通过铰链区连接形成)。这部分功能是识别肿瘤相关抗原，把CAR-T细胞结合到肿瘤上去。跨膜区通常由CD3、CD28、CD8等二聚体蛋白构成。胞内信号转导区主要为免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常为CD3ζ或FcεRIγ)。其主要功能是把信号转导给T细胞，提高抗肿瘤及细胞因子分泌能力。CAR通过不断地改进，目前已经发展到了第四代。第一代CAR主要由识别肿瘤相关抗原的scFv和ITAM(通常为CD3ζ)构成，但是由于仅有CD3ζ活化信号，T细胞不能充分增值，且活化的T细胞在体内存活时间短。第二代CAR在一代CAR的基础上加入一个共刺激分子，如CD28、CD134、CD137等等，增强了T细胞激活、增殖，体内维持时间，从而提高抗肿瘤的效应。第三代CAR在二代CAR的基础上再引入一个以上的共刺激分子。第四代CAR(TRUCKS，T cells redirected for universal cytokine killing)主要通过引入IL-12，IL-23，IL-27等细胞因子，召集固有免疫细胞-巨嗜细胞等杀伤TAA阴性的肿瘤细胞。CAR-T治疗是利用嵌合抗原受体可以特异性地识别肿瘤相关抗原(TAA，tumor associated antigen)靶点，结合后将信号传到胞内，引起T细胞的激活和增增，清除肿瘤细胞。修饰后的T细胞不受肿瘤微环境的抑制，以非MHC(major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体)限制方式抵御肿瘤细胞。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种c-Met特异性嵌合抗原受体。本专利技术的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。本专利技术的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。为了实现上述目的，本专利技术提出的一种c-Met特异性嵌合抗原受体，由人抗c-Met单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述人抗c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。优选地，所述人抗c-Met单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。优选地，所述人抗c-Met单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。优选地，所述人抗c-Met单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。优选地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。优选地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。优选地，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成的结构域为T细胞共刺激信号传导结构，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。本专利技术还提出的上述c-Met特异性嵌合抗原受体在制备治疗c-Met相关肿瘤药物中的应用。c-Met相关的肿瘤包括肝癌、肠癌、神经胶质瘤等。本专利技术根据实验室从全人源抗体库筛选出c-Met抗体Fab(可参见中国专利技术
专利《抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用》，申请号为201110065209.2，公开日为2011年9月7日，公开号为102174106A)，经过密码子优化，基因合成抗c-Met的ScFv序列，并将合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ中，即构建成c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体，即获得本专利技术的嵌合抗原受体c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。利用嵌合抗原受体与逆转录病毒包装质粒RD114在GP2-293T细胞包装成逆转录病毒，利用该病毒感染T淋巴细胞。利用Elisa检测CAR-T细胞在抗原刺激下IFN-γ的分泌及CCK8法对c-Met阳性的肝癌细胞的杀伤作用。本专利技术公布了c-Met特异性的嵌合抗原受体的结构，体外感染T淋巴细胞。修饰后的T淋巴细胞释放IFN-γ等杀伤肿瘤细胞。c-Met特异性的嵌合抗原受体可以用于c-Met相关肿瘤的靶向治疗。附图说明图1为本专利技术实施例1所得c-Met-scFv的重链可变区和轻链可变区的电泳图；其中M为标准标记物，1为c-Met-scFv的重链可变区，2为c-Met-scFv的轻链可变区。图2为本专利技术实施例1所得质粒重组的电泳图；其中M为标准标记物，1为c-Met CAR载体，2为经XbaII，BamI逆转录病毒载体CD8TM-CD137-CD3ζ，3为c-Met scFv。图3为本专利技术实施例2中采用Western Blotting检测本专利技术所得c-Met特异性嵌合抗原受体转染293T细胞后的表达，其中1为作为对照的未转染293T细胞，2为转染逆转录病毒CD19CAR质粒的293T细胞，3为转染逆转录病毒c-Met CAR质粒的293T细胞。图4为Western Blot检测不同的对数生长期肿瘤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种c‑Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗c‑Met单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。
【技术特征摘要】
1.一种c-Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗c-Met单链抗体，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞内信号结构串联构成。2.根据权利要求1所述c-Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述c-Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1-3任一项所述c-Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗c-Met单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；优选地，所述人抗c-Met单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.根据权利要求1-4任一项所述c-Met特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗c-Met单链抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；优选地，所述重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.根据权利要求1-5任一项所述c-M...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯振卿，朱进，许国贞，刘振云，唐奇，唐小军，周荧，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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