一株砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1及其应用制造技术

一株砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1及其应用，属于食品安全检测技术领域。本发明专利技术通过砷完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1。此细胞株FG1分泌的单克隆抗体可识别砷离子，特异性好和灵敏度高，可以用于食品安全中砷的残留检测。本发明专利技术获得的抗砷离子单克隆抗体细胞株FG1，对砷有较好的检测灵敏度和特异性（IC50值为1μg/mL）。该细胞株FG1分泌的抗体稳定性好：杂交瘤细胞冻存于液氮中至少保存5年，纯化的抗体在‑20℃冰箱中至少可存放2年；抗体特异性高：与其他金属离子暂未发现交叉反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1及其应用，属于食品安全检测

技术介绍
砷，俗称砒，是一种类金属元素，单质以灰砷、黑砷和黄砷这三种同素异形体的形式存在。砷元素广泛的存在于自然界，共有数百种的砷矿物已被发现。砷与其化合物被运用在采矿、冶金、化工、农药等产业中。砷的化合物均有剧毒，三价砷毒性最强，其化合物三氧化二砷就是俗称的砒霜，是种毒性很强的物质。砷可通过呼吸道、消化道和皮肤接触进入人体。如摄入过量，就会聚集在人体的肝、肾、肺、脾、子宫、胎盘、骨骼、肌肉等部位。目前常用的砷检测方法有分光光度法、原子吸收法、色谱法等仪器检测方法，检测耗时长、费用高，难以用于现场检测。因此建立一种快速简便的砷检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆抗体是免疫学检测的前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株对砷离子具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1。本专利技术的技术方案，一株砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12021。砷单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.12021的砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1分泌产生。所述砷单克隆抗体的应用，其可用于食品安全中砷的残留检测。本专利技术提供的细胞株FG1的制备基本步骤为：1、完全抗原的合成：a、偶联物GSH-BSA的制备：称取谷胱甘肽（GSH）35.8mg，EDC 56.9mg，NHS 35.6mg，用1mL MES缓冲液溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。称取牛血清蛋白（BSA）112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L 的PBS缓冲液中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物GSH-BSA混合液，通过透析分离偶联物和未偶联的小分子GSH，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；b、偶联物As-GSH-BSA的制备：取0.9mg砷标液逐滴滴加到步骤a制得的GSH-BSA偶联物中，室温搅拌反应12h，即得As-GSH-BSA偶联物，通过透析分离完全抗原和未偶联的砷，并通过紫外吸收扫描方法鉴定，作为免疫抗原。用谷胱甘肽将砷偶联到卵清蛋白（OVA）上，制成检测抗原As-GSH-OVA。2、小鼠的免疫：砷免疫抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用完全免疫原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；3、细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株FG1；4、杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术获得的抗砷离子单克隆抗体细胞株FG1，对砷有较好的检测灵敏度和特异性（IC50值为1μg/mL）。该细胞株FG1分泌的抗体稳定性好：杂交瘤细胞冻存于液氮中至少保存5年，纯化的抗体在-20℃冰箱中至少可存放2年；抗体特异性高：与其他金属离子暂未发现交叉反应。生物材料样品保藏：单克隆细胞株FG1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.12021，保藏日期2016年1月20日。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过用砷离子免疫原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对砷有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1。实施例 1：杂交瘤细胞株FG1的制备1、完全抗原的合成a、偶联物GSH-BSA的制备：称取谷胱甘肽（GSH）35.8mg，EDC 56.9mg，NHS 35.6mg，用1mL MES缓冲液溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。称取牛血清蛋白（BSA）112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS缓冲液中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物GSH-BSA混合液，通过透析分离偶联物和未偶联的小分子GSH，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；b、偶联物As-GSH-BSA的制备：取0.9mg砷标液逐滴滴加到步骤a所制得的GSH-BSA偶联物中，室温搅拌反应12h，即得As-GSH-BSA偶联物，通过透析分离完全抗原和未偶联的砷，并通过紫外吸收扫描方法鉴定，作为免疫抗原。用谷胱甘肽将砷偶联到卵清蛋白（OVA）上，制成检测抗原As-GSH-OVA。2、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取砷免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。3、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1︰10 的比例混合，离心后用质量浓度50% 的PEG聚乙二醇溶液融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含质量浓度为20%的胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，体积浓度为5%的CO2的培养箱中培养。4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含质量浓度为20%的胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用As3+为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对As3+标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株FG1。5、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。使用间接竞争本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12021。

【技术特征摘要】
1.一株砷单克隆抗体杂交瘤细胞株FG1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12021。2.砷单克隆抗体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，邹淑珍，匡华，徐丽广，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，马伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32