本发明专利技术提供一种内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法。所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。所述方法包括构建含有编码Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒的核酸片段对应的cDNA的质粒载体，然后将所述质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达，接着分离纯化得到所述假病毒颗粒。所述假病毒颗粒能作为轮状病毒检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。通过本发明专利技术的方法可以制备具有无传染性、浓度高、稳定性好的假病毒颗粒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种内含轮状病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。
技术介绍
人轮状病毒(rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科，1973年由澳大利亚学者发现，按照内层衣壳蛋白VP6的组特异性抗原表位不同，可将RV分为A～G共7个群，仅有A、B、C三个群感染人，其中A群RV是引起全世界婴幼儿严重胃肠炎的主要病原。RV广泛存在于自然界，传染性强，病人和隐性携带者均为传染源。病毒随粪便排出体外，一般经粪-口途径传播，也可通过飞沫经由呼吸道传播，常常引起严重的公共卫生问题与食品安全问题。RV的检测是临床诊断、口岸检疫、食品卫生检验等领域的关键技术。近年来随着分子生物学的快速发展，实时荧光RT-PCR技术由于其高灵敏性、高时效性、高通量性等优点而成为RV检测的重要方法，尤其是对于污染病毒含量低但潜在传播重要性大的食品检测领域应用更为广泛。标准阳性样品是检测技术的重要基石，是评价检测结果的重要依据。RV的实时荧光RT-PCR方法没有统一的标准阳性样品作为对照，无法对病毒提取过程与检测结果进行评价。综合国内外的参考文献，大多建议使用阳性腹泻样本作为阳性标准样品，但腹泻样本作为阳性标准样品有以下两个重大缺点：(1)病毒含量不均一，不同患者的腹泻样本中的病毒浓度可能相差数十倍、数百倍，不能用于检测方法灵敏度评价、不同实验室检测结果比对等重要环节；(2)存在严重的生物安全隐患，以活病毒为阳性对照，存在操作人员感染继而引发大范围传染的可能。因此，急需研发一种稳定性好、与病毒高度相似、无生物安全隐患、适用于国际检测标准的标准阳性样品。专利
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于提供一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体构建而得，并包含轮状病毒的核酸片段，该核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。优选地，所述核酸片段是与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列相对应的RNA。优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体中含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒的核酸片段对应的cDNA在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述整体DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。所述大肠杆菌优选是大肠杆菌BL21。本专利技术还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译。优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段的表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。本专利技术还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列和轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。所述核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段优选具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译。本专利技术所提供的假病毒颗粒，由于其中包含轮状病毒的核酸片段，该核酸片段能用作检测轮状病毒的靶标，使得所述假病毒颗粒能作为轮状病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。该核酸片段可以是例如我国出入境检验检疫行业标准《SNT 2520-2010贝类中A群轮状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法》中确定的轮状病毒实时荧光PCR方法检测靶标序列对应的RNA片段，从而能够直接作为该标准的配套标准阳性样品使用，解决了现有技术中存在的“有检测方法没有标准样品”、“研发标准样品未对应标准方法导致适用范围狭窄”、“标准样品与检测方法配套性差”等严重制约轮状病毒检测发展的瓶颈问题。本专利技术所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。利用本专利技术所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得无传染性、拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒。附图说明图1是具体实施方式中QSNRV片段组成的示意图。图2是具体实施方式中质粒载体pET-QSNRV的图谱示意图。图3是PCR扩增的QSNRV片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。图4是质粒载体pET-QSNRV的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QSNRV为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。图6是质粒载体pET-QSNRV在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌BL21对照，泳道2是转化有质粒载体pET-QSNRV、但未进行诱导表达的重组大肠杆菌BL21对照，泳道3和4是转化有质粒载体pET-QSNRV并进行了诱导表达的重组大肠杆菌BL21实验组。图7是示出在15000倍电镜下观察到的假病毒颗粒的图。图8是示出对假病毒颗粒中的轮状病毒核酸片段进行实时荧光RT-PCR检测的扩增曲线图。具体实施方式以下结合实施例以及附图对本专利技术的一个具体实施方式进行详细的说明。实施例1：构建质粒载体pET-QSNRV首先本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。
【技术特征摘要】
1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内含有轮状病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测轮状病毒的靶标。2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述核酸片段是与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列相对应的RNA。3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，其中，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。4.根据权利要求3所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。5.根据权利要求4所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。6.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及轮状病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。7.根据权利要求6所述的质粒载体，其特征在于，所述核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.2所示的序列。8.根据权利要求7所述的质粒载体，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚琳，李风铃，江艳华，朱文嘉，郭莹莹，王联珠，卢立娜，翟毓秀，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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