本发明专利技术公开了一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于生物制药技术领域。本发明专利技术所述的病毒样颗粒疫苗包括可溶性蛋白，该可溶性蛋白为大肠杆菌表达猪圆环病毒II型完整衣壳蛋白基因得到的蛋白。其中该衣壳蛋白基因是筛选自目前国内猪圆环病毒II型流行毒株的衣壳蛋白基因，并且经过密码子优化，不仅能在大肠杆菌中大量表达，而且表达的可溶性蛋白还能形成病毒样颗粒。应用本发明专利技术的方法制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗具有抗原纯度高、免疫原性强等特点，此外该疫苗制备过程简单，生产成本低廉，有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，其主要感染6-15周龄的仔猪，临床表现为进行性消瘦、发热、淋巴结肿大、黄疸、呼吸困难等症状。此外，PCV2与猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、A2型先天性震颤、猪增生性和坏死性肺炎、繁殖障碍等疾病密切相关。PCV2的危害还在于能够使感染的猪只免疫功能受到损伤，从而导致机体抵抗力下降，使机体容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病表现为世界流行，已经给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失，但对PCV2的致病机制研究仍不透彻，目前仅能通过加强饲养管理、疫苗接种等方法控制该病毒在猪群中的爆发。因此，研发一种廉价且有效地猪圆环疫苗显得尤为迫切。研究表明PCV2含有两个主要的开放阅读框，分别为ORF1和ORF2，其中ORF1与病毒的复制相关，免疫原性较弱；ORF2为编码该病毒的主要结构蛋白Cap的基因，Cap是病毒的衣壳蛋白，该蛋白含有可中和病毒的抗原表位，还可自我装配成病毒样粒子，因此ORF2是研制新型疫苗的主要候选基因。此外，有文献报道，Cap蛋白的N端富含碱性氨基酸(如精氨酸)，序列高度保守，其中前41个氨基酸是Cap蛋白的核内化信号肽序列，而位于第12～18与34～41位的氨基酸对Cap蛋白的核定位起着决定性作用。还有研究表明，核定位信号肽区域含有潜在的抗原表位，因此，要想获得更好的保护效果，最好能表达完整的Cap蛋白。但由于Cap蛋白的N端大量精氨酸的存在，严重影响了完整Cap蛋白的大量表达，因此，大多研究人员选择了截短或是部分表达Cap蛋白，大量表达完整的Cap蛋白目前仍是亟待解决的难题。通过本专利技术提供的方法不仅可以大量表达完整的Cap蛋白，而且表达的蛋白还是可溶的，活性高，易于大规模生产。病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLP)是含有病毒一个或多个结构蛋白的空心颗粒，不含遗传物质，其形态、大小、结构及表面抗原和多肽表位与真正的病毒粒子相同或相似，可通过与病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫应答，具有良好的免疫原性，且没有毒副作用。目前，已有部分VLPs疫苗上市，如流感VLPs疫苗、乙肝VLPs疫苗、乳头瘤VLPs疫苗等，说明该类疫苗有巨大的潜力。目前市场上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种，其中关于全病毒灭活苗，由于病毒自身特点和生产工艺的问题，经常出现病毒滴度难以提高等问题，有时需要浓缩才能达到要求。国内使用的亚单位疫苗主要是勃林格公司生产的，该公司生产的PCV2亚单位疫苗是使用杆状病毒表达目的蛋白，生产成本很高，造成很多养殖场难以在生产中使用该疫苗。因此本专利技术使用的大肠杆菌表达系统因其操作简单、表达量高、成本低廉等一系列优点而具有很好的前景。
技术实现思路
为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供上述制备方法获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。本专利技术的再一目的在于提供上述猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)合成目的基因：以PCV2 119-GD01株(PCV2b基因亚型，由本实验分离保存)的Cap蛋白的氨基酸序列为基础，在保证此株Cap蛋白的氨基酸不变的前提下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，使其适合在大肠杆菌中表达，然后委托华大基因公司合成，基因合成时两端加入酶切位点，氨基酸序列见SEQ ID NO：1，合成后的基因命名为rORF2，基因序列见SEQ ID NO：2；(2)重组表达载体质粒的构建：将步骤(1)中获得的rORF2与pET-43.1a空载体分别进行双酶切，然后连接、转化；获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-43.1a-rORF2；(3)重组表达菌株的构建：将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)，获得单菌落，经检测正确后保存，并命名为pET-43.1a-rORF2菌株，即为重组表达菌株；(4)重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET-43.1a-rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达；收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白；(5)疫苗的制备：将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混合、乳化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。步骤(1)中所述的两端加入酶切位点，优选为BamHI和HindIII两个酶切位点。步骤(5)中所述的佐剂优选为法国赛比克公司提供的201佐剂。步骤(5)中目的蛋白与佐剂的混合比例优选为体积比1:1。一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗由上述制备方法获得。上述获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗在制备防治断奶仔猪多系统衰竭综合征的药物中应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：首先，本专利技术的基因是在保证氨基酸不变的情况下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸序列翻译为核苷酸序列，然后获得基因，使被普遍认为的全长Cap蛋白在原核表达系统中表达量低，容易形成包涵体等局限性得到解决，获得了表达量高，且目的蛋白可溶的重组表达菌株，其中上清中目的蛋白约占总蛋白的43.1％。其次，本专利技术表达的为Cap蛋白全长，它包含了Cap蛋白氨基端41aa里面含有的潜在抗原表位，因此本专利技术表达的Cap蛋白相比截短表达的蛋白拥有更齐全的抗原表位，更接近天然病毒衣壳蛋白，更易形成病毒样颗粒，免疫原性更强。一方面，使用本专利技术提供的纯化与去标签联合处理的方法制备蛋白，不仅操作简便，纯度很高，适于大规模生产，而且获得的蛋白不带有任何的标签(目前很多亚单位疫苗都含有标签，如6xHis标签、分泌性信号肽等，这些都不利于病毒样颗粒的形成)，这样也会减少表达的蛋白与天然衣壳蛋白的差异，以至于获得更接近天然病毒的颗粒又一方面，应用上述方法制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗对实验动物没有
致病性，且使用该疫苗免疫后，短时间内能在动物体内产生高水平的猪圆环病毒抗体。附图说明构成本申请一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为大肠杆菌表达的目的蛋白的可溶性的检测结果图；其中，M泳道是蛋白marker；1:pET-43.1a-rORF2诱导表达破碎后上清；2:pET-43.1a-rORF2诱导表达破碎后沉淀；3:pET-43.1a-rORF2诱导表达后全菌；4：空载体诱导表达后全菌；图中箭头所指为融合蛋白。图2为电镜观察目的蛋白的结果图，图中病毒样颗粒得直径20nm左右。图3为免疫仔猪后不同时间血清的抗体水平；其中：横坐标代表不同组别；纵坐标代表以450nm/630nm双波长本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成目的基因：合成两端加入酶切位点的如SEQ ID NO：2的基因序列，基因命名为rORF2；(2)重组表达载体质粒的构建：将步骤(1)中获得的rORF2与pET‑43.1a空载体分别进行双酶切，然后连接、转化；获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET‑43.1a‑rORF2；(3)重组表达菌株的构建：将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL‑21(DE3)，获得单菌落，经检测正确后保存，并命名为pET‑43.1a‑rORF2菌株，即为重组表达菌株；(4)重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET‑43.1a‑rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达；收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白；(5)疫苗的制备：将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混合、乳化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。
【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成目的基因：合成两端加入酶切位点的如SEQ ID NO：2的基因序列，基因命名为rORF2；(2)重组表达载体质粒的构建：将步骤(1)中获得的rORF2与pET-43.1a空载体分别进行双酶切，然后连接、转化；获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-43.1a-rORF2；(3)重组表达菌株的构建：将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)，获得单菌落，经检测正确后保存，并命名为pET-43.1a-rORF2菌株，即为重组表达菌株；(4)重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET-43.1a-rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达；收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊惠英，苗配思，刘洁，高应棋，谢永生，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。